PACINI, Diogo Barth.
SEQUENCIAMENTO AUTOMÁTICO
No Livro DNA – O segredo da vida, de James Watson (2008), temos que:
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A reação em cadeia da polimerase logo se tornou um dos principais burros de carga do Projeto Genoma Humano. O processo é basicamente idêntico ao desenvolvido por Mullis, mas foi automatizado. Já não dependemos de legiões de universitários tresnoitados para realizar a exaustiva transferência de minúsculas quantidades de fluidos par tubos plásticos, pois um moderno laboratório genômico possui linhas de produção controladas por robôs. Num projeto do porte do seqüenciamento do genoma humano, é inevitável que as máquinas que produzem a reação em cadeia da polimerase preparem enormes quantidades de enzimas polimerase resistente ao calor. Por isso, os cientistas do Projeto Genoma Humano ficaram indignados com os polpudos royalties acrescentados ao custo da enzima pelo detentor da patente do processo, o gigantesco complexo industrial-farmacêutico europeu Hoffmann-LaRoche.
Outro burro de carga foi o próprio método de seqüenciar DNA. Também aqui, a teoria química subjacente não era nova; o Projeto Genoma Humano usou o mesmo método desenvolvido por Fred Sanger em meados dos anos 1970. A inovação estava na escala, na mecanização do processo de seqüenciamento.
A automação do seqüenciamento começou a ser desenvolvida no laboratório de Lee Hood, no Caltech. Em seus dias de jogador de futebol americano num colégio em Montana, Hood fez com que seu time ganhasse sucessivos campeonatos estaduais e levaria consigo a academia tudo o que aprendera sob trabalhar em equipe. Seu laboratório congregava uma mistura eclética de químicos, biólogos e engenheiros, e logo se tornou um dos lideres em inovação tecnológica.
Na verdade, o seqüenciamento automatizado nasceu das idéias de Lloyd Smith e Mike Hunkapiller. Quando trabalhava no laboratório de Hood, Hunkapiller procurou Smith para falar sobre o método de seqüenciamento que usava um corante diferente para cada tipo de base. Em principio, a idéia prometia tornar o processo de Sanger quatro vezes mais eficiente: em vez de quatro reações de seqüenciamento separadas, cada uma das banda do gel distinta, o código de cores permitiria realizar tudo num único conjunto de reações e ober um resultado numa única banda de gel. Smith mostrou-se inicialmente pessimista, temendo que as quantidades de corantes especiais que ficam fluorescentes sob raios laser.
Segundo o método-padrão de Sanger, cria-se uma série de fragmentos de DNA, que são selecionados pelo gel de acordo com o tamanho de cada um. Cada fragmento é “etiquetado” com um corante fluorescente que corresponde ao seu nucleotídeo didesoxi demarcador da cadeia; desse modo, a cor emitida pelo fragmento identifica qual é a base. Em seguida, um laser rastreia o fundo do gel, ativando a fluorescência, e uma célula fotoelétrica ali colocadas diretamente num computador, evitando-se assim o martirizante processo de digitar dados que transtornava o seqüenciamento manual.
Hunkapiller deixou o laboratório de Hood em 1983 e fooi trabalhar para a Applied Biosystem, INC. (ABI), uma fabricante de instrumento que acabara de ser fundada e que produziria a primeira máquina de seqüenciamento Smith-Hunkapiller. Desde então, a eficiência do processo aumentou imensamente: os géis (lentos e difíceis de manusear) foram descartados e substituídos por sistemas capilares de grande vazão – finíssimos tubos nos quais os fragmentos de DNA são separados em alta velocidade de acordo com o tamanho. Hoje, a última geração de seqüenciadores da ABI é de uma rapidez descomunal, sendo alguns milhares de vezes mais ágeis do que o protótipo. Com um mínimo de intervenção humana (cerca de quinze minutos a cada 24 horas), essas máquinas conseguem seqüenciar até meio milhão de pares de base por dia. Em última análise, foi essa tecnologia que viabilizou o Projeto Genoma Humano.
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O desenvolvimento e a utilização de seqüenciadores automáticos tornaram mais rápido e eficiente os seqüenciamento de DNA na medida em que as etapas de leitura do gel e o processamento de sequências são realizados através de computadores. Assim, o surgimento e a utilização de seqüenciadores automáricos foi o maior benefício alcançado com o desenvolvimento da técnica. Em concordância com as técnicas manuais, a reação de seqüenciamento é também realizada através do método de Sanger. Entretanto, devido aos ddNTPs serem marcados com fluoróforos ou invés de isótopos radioativos, os fragmentos de DNA são detectados através de fluorescência induzida a laser. Quando diferentes fluoróforos são empregados e uma vez excitados por um feixe de laser emitem luz em diferentes comprimento de onda. É possível marcar com estes fluoróforos o primer universal M13mp ou então, cada um dos ddNTPs. Assim, uma vez que em cada uma das reações foi empregado um fluoróforo diferente é possível juntar estes produtos numa só reação e realizar a corrida em uma única raia do gel de seqüenciamento. Os produtos da reação de seqüenciamento, marcados com os fluorocromos, ao serem submentidos à eletroforese passam pelo feixe de laser, que promove a excitação dos fluorocromos. A luz emitida pelos fluoróforos é detectada por um fotomultiplicador e a informação é processada através de um computador (CARUSO, 2007).
A utilização de sequenciadores automáticos é essencial quando deseja-se realizar sequenciamneto em larga escala, como por exemplo em projetos genoma. O desenvolvimento e utilização de sequenciadores automáticos torna mais efeciente e rápido o sequenciamento de DNA na medida em que as etapas de leitura do gel e o processamento de sequências são realizadas através de computadores. A reação de sequenciamento é realizada através do método de Sanger (1979), do mesmo modo que no sequenciamento manual. Entretanto, no sequenciamento automático os nucleotídeos estão marcados com fluorocromos ao invés de isótopos radioativos. Quatro diferentes fluorocromos são empregados e uma vez excitados por um feixe de laser emitem luz em diferentes comprimentos de onda. É possível marcar com estes fluorocromos o "primer" universal M13 ou então cada um dos dideoxinucleotídeos (terminadores). Assim, uma vez que em cada uma das reações (A, T, C, G) foi empregado um fluorocromo diferente é possível juntar estes produtos e realizar a corrida em uma única raia do gel de sequenciamento. Os produtos da reação de sequenciamento, marcados com os fluorocromos, ao serem submetidos a eletroforese passam pelo feixe de laser, que promove a excitação dos fluorocromos. A luz emitida pelos fluorocromos é detectada por um fotomultiplicador e a informação é processada através de um computador (LABORATÓRIO DE GENÉTICA FUNCIONA /USP, 2001).
O uso dos seqüenciadores automáticos é essencial quando se deseja realizar seqüenciamento em larga escala, como nos projetos genoma. O desenvolvimento e utilização de seqüenciadores automáticos tornam mais eficiente e rápido o seqüenciamento de DNA, já que as etapas de leitura do gel e o processamento de seqüências são realizadas através de programas de computador. A reação de seqüenciamento é realizada através do método de Sanger (1979). Na mistura da reação são utilizados nucleotídeos normais e modificados. Estes últimos não possuem a hidroxila 3’, somente apresentam um H (hidrogênio). Isto impossibilita a ligação do nucleotídeo seguinte, pois não há possibilidade de estabelecimento da ligação fosfodiéster. A quantidade dos dois tipos de nucleotídeos colocados na reação é suficiente para que sejam obtidos fragmentos de todos os tamanhos possíveis de um determinado segmento de DNA. Estes fragmentos serão separados um a um no gel de seqüenciamento, montando a seqüência correta. Quatro diferentes substâncias ligadas aos nucleotídeos modificados são empregadas e, uma vez excitadas por um feixe de laser, emitem luz em diferentes comprimentos de onda, ou seja, emitem quatro cores diferentes. Assim, uma vez que em cada uma das diferentes reações (A, T, C, G) foi empregado um fluorocromo diferente, é possível juntar estes produtos e realizar a eletroforese em um único canal do gel de seqüenciamento. Os produtos da reação de seqüenciamento, marcados com os fluorocromos, ao serem submetidos a eletroforese passam pelo feixe de laser, que promove a excitação dos fluorocromos. A luz emitida pelos fluorocromos é detectada por um fotomultiplicador e a informação é processada através de um computador (PORTAL DA CIÊNCIAS BIOLÓGICAS, 2010).
SEQUENCIAMENTO AUTOMÁTICO EM PLACA DE GEL POLIMERIZADO EM ACRILAMIDA
Conforme o sitio Genesis, 2010:
“O sequenciamento de DNA é um processo que determina a ordem dos nucleotídeos (blocos que constituem a molécula de DNA) em uma amostra. Existem vários métodos disponíveis, e cada um apresenta vantagens e desvantagens.
Um dos mais utilizado é o chamado “método didesoxi” conhecido também como de “terminadores de cadeia” ou de “Sanger”; ele constitui a base da metodologia empregada no sequenciamento do genoma humano. Sua estratégia consiste em identificar, continuamente e sequencialmente durante o processo, o último nucleotídeo incorporado na extremidade de alongamento da cadeia. Os produtos da reação deverão também portar uma “marca” que permita detecta-los na etapa de análise. Resumidamente, o processo é realizado a partir de uma cadeia simples (não dupla) do DNA a ser sequenciado; esta servirá de molde para gerar a outra metade complementar da dupla hélice. Isto é obtido pela desnaturação da “molécula nativa”
A reação de síntese se processa em condições iônicas e de pH apropriadas, na presença da enzima DNA polimerase e de uma mistura dos 4 nucleotídeos sob a forma de 3’-desoxinucleotídeo trifosfatos (dNTPs): dATP, dCTP, dGTP e dTTP sendo um deles marcado radioativamente com ³²P ou ; um dos mais utilizado é o dATP ³²P. Como a enzima utilizada catalisa somente o alongamento da cadeia nascente é necessário também, a presença na reação, de um pequeno fragmento de DNA sintético (XXX) complementar a uma região conhecida (YYY) na extremidade 3’ do DNA molde; estas características permitirão sua hibridização no local mencionado, e fornecerão um ponto de partida para a replicação do DNA. O fragmento XXX, denominado iniciador ou “primer", quando marcado, poderá ser utilizado para rastrear o fragmento de DNA recém sintetizado no lugar do dNTP. Fato importante no processo é que ele é executado em quatro reações separadas; cada uma delas, contendo adicionalmente pequena quantidade de um (e apenas um) dos 4 tipos de cada dNTP sob a forma de análogo, 2’, 3’-didesoxinucleotídeo trifosfatos (ddNTPs)
Estes análogos conhecidos como “terminadores” quando incorporados à cadeia nascente, por não apresentarem 3’OH que permita formar ligação com o próximo dNTP a ser adicionado, bloqueará todo processo. Como todos os nucleotídeos normais (dNTPs) estão presentes, o alongamento da cadeia prosseguirá até que a enzima DNA-polimerase insira um análogo (ddNTP). Consequentemente, haverá parada imediata da reação de síntese no ponto em que seu alongamento foi interrompido: na extremidade e, a molécula estará marcada com ³²P. Os fragmentos assim obtidos, cada qual contendo um resíduo final conhecido, pois se sabe em que tubo de reação o análogo foi adicionado, são separados por tamanho em gel de poliacrilamida individualmente: um canal de análise para cada reação. O gel é “transferido” para um suporte de nitrocelulose (filtro).
Após auto-radiografia a ordem dos nucleotídeos, na cadeia de DNA recém sintetizada, pode ser visualizada e obtida diretamente; esta é complementar à da molécula sequenciada: que serviu de “molde”. Levando estas observações em consideração, é possível conhecer a sequência de nucleotídeos do DNA sequenciado de 3’para 5’ partindo-se da parte inferior para a superior do gel.
O método pode ser automatizado através de “maquinaria apropriada” gerenciada por computadores com “softs” que lêm sequencialmente e identificam os produtos. Isto permitirá executar o processo em grande escala. Neste caso utilizam-se simultaneamente os 4 didesoxinucleotídeos terminadores (ddNTPs) marcados por fluorescência. Como cada reação (A,T,G,C) utilizou um fluorocromo diferente os produtos podem ser reunidos e a eletroforese destes realizada em um único canal do gel de sequenciamento. O sinal fluorescente diferencial emitido por cada fragmento, após iluminação com um feixe de laser, identificará os produtos baseado na diferença de comprimento de onda. A luz emitida é detectada por “escaneamento” do gel e a sequência deduzida por computador. Variáveis mais modernas, consequentemente mais rápidas e poderosas, incluem a robotização total do processo com a inclusão das etapas de purificação e da reação de síntese da cadeia do DNA.”
SEQUENCIAMENTO AUTOMÁTICO COM ELETROFORESE CAPILAR
O pesquisador Zukurov em seu sitio descreve:
“Como exemplo vamos mostrar os mecanismos de funcionamento dos mais famosos seqüenciadores automáticos em capilar. Os modelos mais utilizados são 310 Genetic Analyzer, 3100 Genetic Analyzer, 3100-Avant Genetic Analyzer, 3130 Genetic Analyzer, 3130xl Genetic Analyzer, 3730 DNA Analyzer, 3730xl DNA Analyzer. A principal diferença entre todos estes modelos é o número de capilares, para se ter uma pequena idéia o 310 Genetic Analyzer possui apenas um capilar, em outras palavras, corre apenas uma amostra de cada vez. O 3730xl DNA Analyzer por sua vez possui 96 capilares, ou seja, corre até 96 amostra de uma vez. Entretanto não se justifica correr 96 amostra em 96 capilares, os custos se tornam muito elevados...
O seqüenciador capilar separa fragmentos de DNA utilizando os polímeros POP4, POP6 e POP7. Os tipos de polímeros variam de acordo com o modelo utilizado. Este equipamento raliza seqüenciamento automático e análise de fragmentos longos, médios e curtos, utilizando capilares de 80, 50 e 36 cm respectivamente. Os tamanhos dos capilares também variam de acordo com o modelo de seqüenciador empregado, por exemplo, o 310 Genetic Analyzer utiliza capilares de 36 cm, os modelos mais avançados podem utilizar os três tamanhos diferentes.
Estes seqüenciadores automáticos analisam as moléculas através do processo de eletroinjeção, na qual não há injeção de volume e sim de moléculas, por isso cada amostra pode ser corrida até cinco vezes. Estes seqüenciadores podem ser utilizados para outras funções além de seqüenciamento, como por exemplo: SNP detection, detecção de diferente mutações, identificação humana por análise de fragmentos, análise de fragmentos amplificados pela PCR através do softwares GeneScan que permite uma sensibilidade muito maior que a detecção por eletroforese em gel.
As reações de seqüenciamento são realizadas em tubos cônicos do tipo a – tube, estes tubos são inseridos no seqüenciador em um suporte (autosampler tray) com capacidade para 48 ou 96 amostras. O auosampler tray proporciona um contato consecutivo de cada amostra com o eletrodo catado que esta em paralelo a extremidade final do capilar cheio de polímero separador. Na outra extremidade do capilar no suporte do tampão (buffer), um eletrodo anodo esta em paralelo a extremidade do capilar que esta imersa no buffer.
As moléculas entram no capilar em um fluxo constante, sempre do catodo em direção ao anodo. O período curto em que a eletroforese ocorre no capilar imerso na amostra é chamado de eletroinjeção, pois o volume da amostra continua o mesmo, ou seja, apenas moléculas carregadas como os DNA migram na direção oposta de sua carga.
Quando os fragmentos de DNA atingem a janela de detecção no capilar, um laser excita os corantes fluorescentes. A emissão proveniente dos diferentes corantes possui cada uma um comprimento de onda diferente, sendo estes diferentes espectros coletados pela câmara CCD (charge – coupled device) também conhecido como dispositivo de carga acoplado. O software de seqüenciamento interpreta os resultados, titulando cada base em relação à intensidade do composto fluorescente, denominado quatro cores especificas.
O software para analise do seqüenciamento, utiliza as mesmas quatro cores especificas para cada base. Por convenção, A ficou como verde, C como azul, G como preto e T como vermelho na visualização do eletroferograma.
Rhodamine Dye Terminators – Os corantes fluorescente dRhodamina, são aderidos especificamente aos ddNTPs.
(...)”
SHOTGUN
Essa técnica dispensa a etapa de mapeamento físico, umas das tarefas mais difíceis e demoradas. O genoma do organismo é fragmentado em pequenos pedaços, por quebra mecânica (sonicação ou nebulização) e diversas bibliotecas são geradas desses fragmentos aleatórios. O tamanho dos fragmentos clonados varia entre 1000 a 4000 pb, podendo chegar a 10.000 pb, as extremidades de um grande número de clones são seqüenciadas e utilizadas para montagem do genoma completo. Apesar de ser estratégia mais rápida, demanda uma alta capacidade computacional para processamento das sequências e montagem correta do genoma. Esta estratégia tem sido empregada para o seqüenciamento de inúmeros genomas de procariontes como de bactérias, por exemplo Xilela fastidiosa e Gluconacetobacter diazotrophicus (consórcio TIOGENE) dentre outras, e também tem sido utilizada para genomas de eucariontes, bem maiores, incluindo o genoma humano. Um grande problema para os projetos de seqüenciamento genômico é a grande quantidade de regiões do genoma com sequências repetidas, o que, dentre outros problemas, dificulta bastante o trabalho final de bioinformática para montagem das sequências. Para suplantar esse problema, mesmo quando se utiliza a estratégia “shotgun” pode ser utilizadas bibliotecas com grandes fragmentos de DNA para auxiliar a ordenação dos clones e montagem do genoma. Alem de diminuir a quantidade de seqüenciamento das bibliotecas “shotgun”. No caso de genomas de organismos eucariontes superior, além da quantidade de DNA repetitivo ser muito maior, esses problemas são agravados pelo fado dos genes possuírem íntrons dificultando ainda mais a montagem e localização das regiões codificantes do genoma. Uma alternativa nesse caso é seqüenciar apenas o Genôma Funcional, ou seja, o DNA complementar ao RNA mensageiros ou ao cDNA. Nesse caso, o RNA total do organismo é extraído, utilizando a síntese de cDNA através da enzima transcriptase reversa, o cDNA é então clonado e seqüenciado (TEXEIRA, 2006; ZUKUROV, 2007).
PIROSEQUENCIAMENTO (SISTEMA 454)
Segundo Texeira (2006):
“ Apesar do aumento significativo da velocidade de seqüenciamento com a utilização dos seqüenciadores automáticos, baseados no método de SANGER et al. (1977), e o desenvolvimento de diferentes estratégias para o seqüenciamento completo do genoma, ainda há uma grande quantidade de trabalho, tempo e recursos financeiros para obtenção de hesito em um projeto de seqüenciamento. Diversos grupos de pesquisa têm realizado esforços para o desenvolvimento de métodos para a determinação do seqüenciamento de DNA. Três métodos são bastante promissores: seqüenciamento por hibridização (BAINS & SMITH, 1988; DRMANAC et al., 1989; KHRAPKO et al., 1989; SOUTHERN, 1989), seqüenciamento por assinatura paralela, baseado na ligação e clivagem do DNA (BRENNER et al., 2000) e o pirossequenciamento é uma técnica baseada na detecção do pirofosfato (PPi) durante a síntese do DNA pela DNA polimerase. Através de uma cascata de reações uma certa quantidade de luz visível é gerada de acordo com o número de nucleotídeos incorporados. Essa cascata é iniciada com a reação de polimerização do DNA e a liberação do PPi como resultado da incorporação no nucleotídeo pela polimerase. O PPi é subsequentemente convertido a ATP através da ATP sulfirilase, o qual fornece energia para a luciferase oxidar luciferina e gerar luz. Anteriormente esse método não era utilizado para o seqüenciamento de genomas em função da limitação do tamanho das leituras (reads) gerados em torno de 80 e 120 pares de base (RONAGUI et al., 1998). No entanto, diversos aprimoramento tecnológicos possibilitaram a automação da reação e o desenvolvimento de um equipamento capaz de seqüenciar 25 milhões de bases, com uma precisão de 99% ou mais, em apenas 4 horas (AGAH et al., 2004; MARGULIES et al., 2005).
O pirossequenciamento é um método rápido para seqüenciamento que não se baseia em eletroforese. No caso do equipamento desenvolvido pela Roche Apllied Science denominado “Genome sequencer 20 System”, o seqüenciamento pode ser dividido em quatro etapas principais: 1) DNA genômico é isolado e fragmentados com 300 a 800 pares de bases, gerados por nebulização, são ligados a adaptadores e separados em fita simples; 2) os fragmentos ligados são imobilizados em nanoesferas de forma que apenas um fragmento seja ligado a cada esfera; 3) as esferas são capturadas por gotículas de uma emulsão água-óleo contendo os reagentes para a reação de PCR (emPCR).
A reação de PCR ocorre em cada gota, resultando em esferas contendo em torno de 10 milhões de cópias de um único DNA molde; 4) A emulsão e quebra, as fitas de DNA desnaturas, e as esferas contendo clones de DNA fita simples são depositados em poços de uma lâmina de fibra ótica. Pequenas esferas contendo as enzimas necessárias para a reação de pirossequenciamento imobilizadas são depositadas em cada poço. Após a preparação das esferas a reação de seqüenciamento é realizada através da passagem de uma solução contendo o tampão de reação e os nucleotídeos (A, T, G e C) independentemente, com uma lavagem do sistema após a passagem de cada base. A luz gerada é capturada e utilizada para geração do pirograma.
Essa tecnologia tem vantagens na exatidão e facilidade de utilização para diferentes aplicações. Dispensa a clonagem, construção de biblioteca e seleção de clones, marcação de nucleotídeos, e a eletroforese de DNA. Além disso, possui alta flexibilidade e suposta alto nível de automação. Apesar de produzir sequências com tamanhos entre 80 e 120 pares de bases, o que poderia ser um problema para a montagem do genoma, o desenvolvimento de algoritmos matemáticos específicos e o grande número de sequências geradas, torna possível o seqüenciamento de umgenôma bacteriano em poucos dias (MARGULIES et al., 2005). Certamente se para o organismo de interesse já houver algum genoma seqüenciado será muito mais fácil a montagem do genoma e dessa forma, dada a velocidade de seqüenciamento, essa plataforma tecnológica poderá ser muito utilizada para seqüenciamento de genomas microbianos em larga escala e a “tipagem” baseadas na sequência do genoma.”
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