PACINI, Diogo Barth.
EXTRAÇÃO DO DNA
A
extração de DNA de células eucariontes consta fundamentalmente de três etapas:
a) ruptura das células para liberação dos núcleos;
b) desmembramento dos
cromossomos em seus componentes básicos, DNA e proteínas;
c) separação do DNA
dos demais componentes celulares
AS NUCLEASES OU ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
As
enzimas de restrição são endonucleases que clivam o DNA em regiões específicas.
Existem 3 tipos de enzimas de restrição:
Tipo
I = corta o DNA aleatoriamente a 1000 pb do sítio de especificidade;
Tipo
II = cortam no sítio de especificidade ou perto dele;
Tipo
III = cortam a 24 – 26 pb 3’ do sítio de especificidade.
As
enzimas tipo II são as mais usadas em engenharia genética pelo fato de que seu
padrão de clivagem é previsível e controlado. Eles geralmente cortam regiões
específicas dentro de tetra, penta ou hexanucleotídios que tem um duplo eixo de
simetria rotacional. Tais seqüências são denominadas de palíndromos
A ELETROFORESE DO DNA
A
eletroforese em gel de agarose permite estimar a concentração de uma solução
contendo fragmentos de ácidos nucléicos mas, sobretudo, permite separar e
purificar estes fragmentos.
As
amostras são aplicadas no gel e separadas sob ação de um campo elétrico, sendo
que os fragmentos de menor massa molecular migram mais rapidamente que os
fragmentos de maior massa molecular.
Após
a migração ou corrida, os fragmentos são visualizados por coloração com brometo
de etídio, agente intercalante que fluoresce após excitação com luz
ultravioleta (UV). O limite de detecção é de cerca de 10 ng/banda de ácido
nucléico.
A
distância de migração dos fragmentos analisados é inversamente proporcional ao
log10 de seu tamanho. Com auxílio de marcadores de massa molecular
conhecidos, é possível determinar o tamanho de um fragmento. A migração dos
fragmentos de ácidos nucléicos em um gel de agarose é função de seu tamanho, da
concentração do gel e da voltagem aplicada. Nas condições de corrida
utilizadas, os ácidos nucléicos são carregados negativamente, migrando do pólo
negativo para o positivo.
HIBRIDIZAÇÃO E SONDAS GÊNICAS
A
hibridação de ácidos nucléicos, permite o reconhecimento entre seqüências
complementares de DNA ou RNA. Assim, um determinado fragmento de DNA pode ser
localizado em uma mistura heterogenia, desde que se disponha de uma seqüência
complementar ao fragmento. Essa seqüência complementar é chamada de sonda e
consiste em seqüência de nucleotídeos de DNA ou de RNA que forma clonadas ou
sintetizadas in vitro, utilizando-se nucleotídeos marcados com
isótopos radioativos. Quando o DNA é submetido a temperaturas de 90 a 100ºC, os
dois filamentos de polinucleotídeos desnaturam, ou seja, eles se separam. Se
esses filamentos desnaturados são incubados em condições apropriadas de
temperatura (em torno de 65ºC), eles renaturam, ou seja, as bases
complementares paream, formando-se novamente o duplo filamento. Dessa maneira,
formam-se híbridos, entre seqüências complementares de ácidos nucléicos. Se a
sonda radioativa estiver presente no meio de incubação, ocorrerá o pareamento
entre a sonda e o fragmento complementar a ela. Esses híbridos podem ser
formados entre dois filamentos de DNA, dois filamentos de RNA ou um filamento
de DNA com um de RNA
A TÉCNICA DE SOUTHERN E NORTHERN
Para
detectar quais das muitas moléculas de DNA ou RNA em um gel de agarose se
hibridizam a uma sonda em particular , são feitas transferências de Southern
(para DNA) ou Northern (para RNA). As moléculas de ácido nucléico são separadas
por eletroforese em gel de agarose e
estas transferidas para uma membrana de náilon ou nitrocelulose. Isto
geralmente é feito por ação capilar, mais pode ser obtido por
eletrotransferência, transferência a vácuo ou centrifugação. Na transferência
de Southern, antes de ser feita a transferência, o DNA é geralmente desnaturado
com álcali, de modo que é unifilamentar e esta pronto para hibridização, Para o
RNA, isso não é necessário e iria hidrolisar as moléculas. Uma vez feita a
transferência, os procedimentos de Southern e Northern são idênticos.
As
transferências Northern dão informações sobre o tamanho do mRNA e quaisquer
precursores, e podem ser úteis para determinar se um clone de cDNA usado como
sonda tem tamanho total ou se ele é de uma família de transcritos correlatos.
As transferências Southern de fragmento de DNA genômico clonado pode ser
sondadas com moléculas de cDNA para encontrar quais partes do clone genômico
correspondem ao fragmento de cDNA. Se a transferência de Southern contem
fragmentos de DNA genômico de todo o genoma, a sonda dara informações sobre o
tamanho do fragmento onde está o gene no genoma, e quantas cópias de gene estão
presentes no genoma.
O FINGERPRINT
Se as
transferências de Southern do DNA genômico digerido por enzimas de restrição de
membros de uma família são hibridizados com uma sonda que detecta um destes
tipos de repetição, cada amostra apresentará um conjunto de bandas de tamanhos
variados. Algumas destas bandas são comuns às da mãe, e algumas às do pai, e o
padrão de bandas será diferente de uma pessoa não aparentada. Os padrões
diferentes de indivíduos em cada um destes tipos simples de repetição significa
que, usando um pequeno numero de sondas, a possibilidade de dois indivíduos
terem o mesmo padrão torna-se extremamente pequena. Esta é a técnica de
fingerprinting de DNA, que é usada na ciências forense para eliminar o inocente
e condenar os criminosos. Também é aplicada para testes de maternidade e
paternidade em humanos. Também pode ser usada para mostrar heredograma em
animais cruzados comercialmente, e para descobrir hábitos reprodutivos em
animais selvagens. O Fingerprint pode ser feito com pequenas amostras de DNA
tais como mancha de sangue ou folículo de cabelo em uma cena de crime.
A SÍNTESE DE DNA
SÍNTESE DE
OLIGONUCLEOTÍDEOS
A síntese de oligonucleotideos tanto de DNA e RNA são
feitos por equipamentos automatizados. Os oligonucleotídeos são sintetizados utilizando-se um
sintetizador de DNA, que é basicamente um sistema computadorizado de liberação
de reagentes. A síntese de DNA é um processo cíclico que reúne uma cadeia de
nucleotídeos da extremidade 3' para 5'. A primeira base é acoplada em um
suporte sólido e monômeros de nucleotídeos são adicionados um a um, através de
um ciclo de 4 reações químicas.
A síntese de oligonucleotideos e oligopeptideos tornou-se
uma tarefa laboratorial altamente simplificada. O DNA pode ser sintetizado sob
a forma de fita simples, tanto de pequeno tamanho, quanto de tamanho maior.
Usando as fitas de pequeno tamanho pode introduzir-se mutações em genes. As
fitas de DNA de grande tamanho (200pb) usam-se tanto como sondas, como para
construir genes sintéticos (primers) que têm a enorme vantagem de possuir
sítios de clivagem para as endonucleases de restrição, que não se encontram nos
genes naturais, o que torna a manipulação daqueles muito mais facilitada.
SINTESE DE
cDNA
A
descoberta da enzima transcriptase reversa, uma DNA polimerase dependente de
RNA encontrada predominantemente em vírus de RNA de tumor, tornou possível a
síntese in vitro de DNA usando-se como molde mRNA. O DNA produto dessa
reação é o DNA complementar ou cópia da mensagem, abreviadamente chamado de
cDNA. A síntese e possível clonagem de cDNAs contribuiram para grandes avanços
na análise da estrutura e expressão de genes de eucariotos e propiciaram uma
revolução tecnológica nas indústrias farmacêutica e de alimentos. Esses clones
são comumente isolados de bibliotecas de cDNA, construídas a partir da
população de mRNA isolada da célula ou do tecido de interesse. Portanto, em
comparação com bibliotecas do genoma total essas bibliotecas são enriquecidas
com seqüências gênicas. Uma vez que o cDNA é cópia da mensagem, ele não contém
introns e apresenta significativamente poucas seqüências que não codificam para
proteínas. A ausência de introns permite que cDNAs relativos a células de
eucariotos superiores sejam diretamente transcritos e traduzidos em bactérias e
em outros microorganismos, permitindo assim a produção em grande escala de
polipeptídeos importantes tanto na área de pesquisa como na área aplicada. A
ausência de introns também facilita a determinação direta da seqüência da mensagem
e subsequente dedução da seqüência de aminoácidos da proteína por ela
codificada. Isso tem resultado na identificação da seqüência de uma enorme
quantidade de proteínas, algumas vezes mesmo antes de terem sido identificadas
genética ou bioquimicamente.
A REAÇÃO EM CADEIA DE POLIMERASE (PCR)
É
uma técnica capaz de obter grandes quantidades de fragmentos individuais de DNA
in vitro, isso é possível graças a utilização da DNA-polimerase que são
extraídas da bactérias Thermus aquaticus, que vive em fontes de água
quentes, e, por isso, foi denomidada Taq-polimerase. Essas enzimas são
utilizadas para adicionar ao desoxirribonucleotídeos a um pequeno segmento de
DNA, ou primer, que dirige a síntese do novo segmento de DNA sobre o molde onde
o primer se ligar. A PCR pode ser dividida em três etapas fundamentais. (1) A
mistura da amostra de DNA + Taq-polimerase + primers + os quatros nucleotídeos
que compõem a molécula de DNA (dCTP, dATP, dGTP e dTTP) é submetida a uma
temperatura de 92-94ºC, para que ocorra a separação dos dois filamentos de DNA.
(2) Abaixamento da temperatura para que o primers se liguem às extremidades 3’
de cada filamento de DNA, que têm as seqüências
de nucleotídeos complementares. A Taq-polimerase vai adicionando
nucleotídeos às extremidades 3’ dos primers, copiando os filamentos de DNA e
formando filamentos complementares a cada um deles. (3) A temperatura é
novamente elevada, fazendo com que os novos filamentos de DNA se separem dos
antigos, que foram usados como molde. Ao final, o processo volta a repetir
várias vezes. Em cada ciclo, o número de genes (segmento de DNA) é duplicado,
e, como cada ciclo dura 2-3 horas, em algumas horas o DNA podes ser copiado
bilhões de vezes. Além de rápida, a PCR é uma técnica tão sensível que pode amplificar
o DNA de uma única célula.
O SEQÜENCIAMENTO DO DNA
O
sequenciamento de DNA é um processo que determina a ordem dos nucleotídeos
(blocos que constituem a molécula de DNA) em uma amostra. Existem vários
métodos disponíveis, e cada um apresenta vantagens e desvantagens.
Um dos mais
utilizado é o chamado “método didesoxi” conhecido também como de “terminadores
de cadeia” ou de “Sanger”; ele constitui a base da metodologia empregada no
sequenciamento do genoma humano. Sua estratégia consiste em identificar, continuamente e sequencialmente durante o processo,
o último nucleotídeo incorporado na extremidade de alongamento da cadeia.
Os produtos da reação deverão também portar uma “marca” que permita detecta-los
na etapa de análise. Resumidamente, o processo é realizado a partir de uma
cadeia simples (não dupla) do DNA a ser sequenciado; esta servirá de molde para
gerar a outra metade complementar da dupla hélice. Isto é obtido pela
desnaturação da “molécula nativa”.
OS ARRAYS
Microarranjo, é uma técnica experimental da
Biologia Molecular que busca medir os níveis de expressão de transcritos em
larga escala, ou seja, medindo muitos (em alguns casos todos os) transcritos
simultaneamente. O termo microarranjo é uma tradução natural e aceita para o termo
em inglês microarray pelo qual esta técnica é mais conhecida.
Um DNA microarray, ou DNA-chip, consiste num
arranjo pré-definido de moléculas de DNA (fragmentos de DNA genômico, cDNAs ou
oligonucleotídeos) quimicamente ligadas à uma superfície sólida, usualmente
lâminas de microscópio revestidas com compostos que conferem carga positiva. Os
microarrays também podem ser preparados em membranas de nylon
positivamente carregadas. Os microarrays são utilizados na detecção e
quantificação de ácidos nucleicos (mRNA na forma de cDNA ou DNA genômico)
provenientes de amostras biológicas, as quais são postas para hibridar com o
DNA fixado no array (hibridação por complementariedade de bases). A
detecção é possível pois as amostras são "marcadas" com fluorocromos
cianina 3 (Cy3) ou cianina 5 (Cy5) quando utiliza-se microarrays em
vidro ou com o isótopo 33-P quando os arrays são preparados em membranas
de nylon.
Para a preparação dos microarrays,
utilizam-se robôs altamente precisos que aplicam as diferentes amostras de DNA
em diminutos pontos (spots) no centro de uma lâmina de microscópio com a
superfície quimicamente preparada (densidade aproximada de 10.000 pontos/cm2).
Nota-se que cada ponto representará um segmento gênico em particular. Quanto
mais pontos no microarray, mais abrangente ele será na análise do
trancriptoma. Também são preparados oligo-microarrays pela tecnologia de
síntese in-situ (mais apropriadamente referidos como DNA-chips). Neste
caso, os oligonucleotídeos são sintetizados na própria lâmina numa densidade de
30-50.000 pontos/cm2. A tecnologia dos microarrays tem impulsionado de
maneira importante a pesquisa de genômica funcional dos diferentes
organismos, desde bactérias até o homem, incluindo situações normais e
patológicas (câncer, doenças autoimunes, doenças degenerativas entre outras).
GLOSSÁRIO
Adenilato Ciclase – Enzima
ligada à membrana celular que catalisa a síntese de AMP (adenosina monofostato)
cíclico ou cAMP, a partir de ATP. O cAMP é um componente importante de diversas
vias intracelulares transmissoras de sinais recebidos pela célula.
AMP cíclico – Adenosina
monofosfato cíclica, uma molécula importante na transmissão intracelular de
sinais.
Anticódon – Os três
nucleotídeos, na molécula do RNA de transferência, que reconhecem o códon do
RNA mensageiro. A complementaridade entre o anticódon e o códon serve para
inserir, na molécula protéica, o aminoácido transportado pelo RNA de
Transferência.
ATPase – Enzima muito
abundante nas células, que rompe a ligação química do grupo fosfato terminal do
ATP, liberando energia e gerando ADP e fosfato inorgânico.
ATPsintetase – Complexo
enzimático encontrado na membrana interna das mitocôndrias, na membrana dos
cloroplastos e na membrana plasmática das bactérias. Catalisa a síntese de ATP
a partir de ADP e fosfato inorgânico.
cDNA – O mesmo que DNA
complementar; molécula de DNA sintetizada como uma cópia de um RNA mensageiro,
que é constituída somente por éxons, sem íntrons. Usado para determinar na
seqüência de aminoácidos numa proteína, pela determinação da seqüência de
nucleotídeos no cDNA ou para produzir grandes quantidades de proteína.
Cinases – Enzimas que
transferem um grupo fosfato de um nucleosídeo trifosfato, como ATP, para outra
molécula.
Códon – Seqüência de três
nucleotídeos, na molécula do RNA mensageiro, que representa a instrução para a
incorporação de um determinado aminoácido no polipeptídeo em formação.
Códon de iniciação – é o
códom AUG, onde ribossomos se prende ao RNA mensageiro, assegurando a leitura
correta do mRNA, e a síntese do polipeptideo com a seqüência correta de
aminoácidos.
Códon de terminação –
seqüência de três nucleotídeos, na molécula de RNA mensageiro, que significa a
instrução para o término da síntese do polipeptideo. Há mais de um códon de
terminação.
DNA recombinante –
molécula de DNA contendo seqüências nucleotídicas provenientes de mais de uma
fonte.
DNA-polimerase – Enzimas
que participam da síntese de novos filamentos de DNA, copiando os filamentos
antigos.
DNA-satélite – DNA
altamente repetitivo (muitos nucleotideos iguais) que se concentra na
heterocomatina constitutiva (não confundir com satélite do cromossomo).
Endonuclease de restrição
– Também conhecida como enzima de restrição.
Engenharia genética -
conjunto de técnicas e métodos que permitem a manipulação do material genético.
Enzimas de Restrição -
enzimas que cortam o material genético em lugares definidos.
Estampagem (imprinting) –
sistema de marcas químicas agregadas ao cromossomos que servem de indicação
sobre quais genes podem ou devem ser transcritos.
Éxons – as partes da
moléculas de um pré-RNA mensageiro (ou seu equivalente no DNA) que vão
codificar uma cadeia polipeptídica após remoção dos íntrons.
Helicase – enzima que
separa as duas cadeias do filamento duplo de DNA, consumindo energia do ATP
para romper as pontes de hidrogênio entre as bases. Essencial para a replicação
do DNA e para a síntese de RNA na transcrição.
Hibridização in situ
– técnica para a localização de gene (DNA) ou de RNA mensageiro. O ácido
nucléico em estudo é conservado no seu local celular, e sobre ele se faz reagir
moléculas conhecidas e marcadas de DNA ou de RNA (sondas ou probes). A
identificação da molécula marcada indica a localização do gene ou do mRNA
procurado.
Íntrons – as partes da
molécula de um pré-RNA mensageiro, ou seu equivalente no DNA, que são removidas
por “splicing”, para possibilitar a junção dos éxons que irão constituir
a molécula de RNA mensageiro.
Ligase - enzima usada para
a ligação de moléculas de ácidos nucléicos.
RNA heterogêneo – também
designados de hnRNAs, é um grupo complexo de moléculas de RNA intracelulares,
algumas muito grandes, e incluindo os pré-RNAs. Este últimos, depois de
processos por splicing dão origem aos RNAs mensageiros.
RNA mensageiro – ou mRNA,
é a molécula intermediária entre um gene e o polipeptídeo codificado por ele. A
molécula do RNA mensageiro é sintetizada sobre um filamento de DNA e contém a
informação para codificar um determinado polipeptídeo.
RNA polimerase I – a
enzima de transcrição encontrada nas células que sintetiza os RNAs
ribossômicos.
RNA polimerase II – a
enzima de transcrição encontrada nas células eucariontes, que sintetiza os RNAs
mensageiros, e a maioria dos RNAs de moléculas pequenas.
RNA polimerase III – a
enzima de transcrição encontrada nas células eucariontes, que sintetiza os RNAs
de tranferência e o RNA dos ribossomos.
SnRNA – as letras sn vêm
do inglês SMALL NUCLEAR. Pequenas moléculas de RNA encontradas exclusivamente
no núcleo celular, que fazem parte do spliceosomes e participam da
remoção dos íntrons das moléculas de RNA mensageiro.
Tecnologia do DNA Recombinante
- a totalidade de métodos que, através de técnicas de biologia molecular,
permitem a manipulação do material genético.
Transcriptase – Enzima que
participa da fabricação de moléculas de RNA copiando um modelo de DNA no
processo denominado transcrição.
Transcriptase reversa –
também chamada de transcriptase inversa; enzima que sintetiza DNA copiando uma
molécula de RNA; importante para a multiplicação dos víruas com genoma de RNA
(retrovirus).
BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
JUNQUEIRA, L. C.; CARNEIRO, José – Biologia celular e
molecular. 7ª ed., Rio de Janeiro, Guanabara Koogan, 1998.
LEITE, Marcelo – Folha Explica: O DNA. São Paulo,
Publifolha, 2003.
MALAJOVICH, Maria Antonia – BIOtecnologia. Rio de
Janeiro, Axcel Books do Brasil Editora, 2004.
TURNER, P.
C.; MCLENNAN, A. G.; BATES, A. D.; WHITE, M. R. H. - Biologia Molecula. 2ª ed., Rio de Janeiro, Guanabara Koogan, 2004.
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WATSON, James D.. DNA – O
segredo da vida: 4ª ed., Companhia de letras, 2008.
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