PACINI, Diogo Barth.
Banco genômico é uma biblioteca que
contém fragmentos de DNA clonados em um numero de vetores. No banco genômico
ficam armazenados diversos porções do DNA para que a sociedade cientifica possa
consultar e/ou comprar esses fragmentos de DNA para diversos fins, tais como
identificação, análise e pesquisa específicas. O Banco genômico em questão é um
banco onde serão pesquisados e clonados DNAs referente a dípteros de interesse
forense.
Os
Dípteros de interesse forense, são aqueles que podem ser encontrados em cenas
de crimes e os estudos destes dípteros podem auxiliar os peritos criminais a
solucionar o crime. Os Dípteros podem ser estudados para serem desvendadas as
questões do IPM (intervalo pós-morte), das possíveis causa da morte, do local
da morte e inclusive o percurso de “desova” deste corpo (quando ocorre). O
grupo Diptera engloba, especialmente neste caso, as Moscas, existem diversas
espécies de moscas necrófagas (se alimentam ou utilizam carne em decomposição
para a reprodução).
O corpo após a morte pode ser
“visitado” por moscas que tem um sentido olfativo extremamente apurado, que
facilita na identificação de indivíduos mortos, isto é, estas moscas não
colonizam corpos vivos. O corpo em decomposição passa por vários estádios, que
vão de estádio inicial de decomposição até a ossificação, cada etapa de
decomposição (período) é colonizado por algumas espécies de moscas, isso
significa que as espécies de moscas que colonizam o corpo no estádio inicial de
decomposição, são diferentes das espécies que colonizam o corpo em outros
estádios, essa diferença facilita a identificação do tempo de morte
principalmente se for superior a 3(três) dias de decomposição.
Existem diversos espécies de moscas
que são endêmicas, isso é, são especificas de certas regiões geográficas,
conhecendo isso, identificando as moscas que estão colonizando o corpo podemos
chegar ao local de morte do individuo e descobrir se o individuo foi morto no
local, ou foi “desovado” naquele local, quer dizer, foi morto em um local
distinto daquele encontrado, caso seja essa a situação, podemos descobrir por
meio da identificação das espécies de moscas, onde o corpo possivelmente passou
após a morte e/ou descobrir o local aproximado da morte.
Sabe-se também que as moscas
colonizam de forma diferente os corpos que tiveram alteração químicas, isto é,
morte por overdose ou se foi morto envenenado. As moscas também são
extremamente sensíveis a umidade, temperatura e a forma de exposição do corpo,
isto é, o clima também pode alterar a forma de colonização do cadáver.
A identificação da moscas podem nos
dar tanto o tempo de morte como local da morte, ou até mesmo a causa da morte,
por isso é muito importante sabermos identificar tais espécies. Se a mosca
coletada estiver no estádio adulto, é fácil identificar por meio de
características morfológicas, mas se for coletado larva, ovo ou pupa, é difícil
identificar, visto que são muito idênticos, além de existir famílias de
dípteros que as espécies que as compões são muito idênticas também em estádio
adulto e nestes necessitam serem feitas análises genética para a identificação.
A finalidade do banco genômico é,
utilizando a técnica de PCR-RFLP em DNAmt, para poder encontrar a porção do DNA
que caracteriza especificamente uma única espécie, e reproduzindo in vitro
esta porção do DNA podemos criar uma biblioteca genômica que os pesquisadores e
peritos poderão ter acesso a porção do DNA que identifica as espécies de
dípteros que podem ser encontradas no local do crime.
O primeiro passo é a extração do DNA
da amostra. Esta extração tem por finalidade solubilizar os ácidos nucléicos e,
em alguns casos, também lisar as células, núcleos e organelas. Para ser
realizada com a desintegração dos tecidos adicionando-se um tampão de extração
(que mantém a integridade das moléculas de ácidos nucléicos), detergentes (que
agem dissociando as proteínas dos ácidos nucléicos e dissolvendo os lipídeos das membranas
celular) e procedendo-se uma homogenização. O extrato é obtido separando-se o
material insolúvel por uma série de centrifugações.
Em seguida é feita a PCR (reação em
cadeia da polimerase) é um método de amplificação, isso é, um método para criar
diversas cópias de DNA sem o uso de um organismo vivo, essa técnica é muito
sensível e por isso tem que ser realizado com muito cuidado para evitar
contaminações que possam atrapalhar o resultado, inviabilizando ou tornando o
resultado errado. Para fazer a PCR inicialmente tem que ser extraído o material
genético, como o produto do banco genômico é ligado a dípteras(Moscas) de
interesse forense, inicialmente faz-se uma coleta das moscas, posteriormente
uma análise morfológica destes, separando por espécie, em seguida se faz um
macerado para separar o DNA, por meio da técnica de RFLP, faz-se a análise das
porções que foram desmembradas do DNA para se descobrir a parte que diferencia
a espécie, normalmente essa parte é encontrada no DNA mitocondrial, visto que
este é herdado exclusivamente da parte materna e é mais protegida do que o DNA
nuclear. Após descoberta esta porção de individualização do DNA, faz-se um
isolamento e em seguida utilizando a técnica de PCR se faz várias cópias para
ser armazenada no banco genômico.
Após extraído o DNA é misturado em
um pré-mix (que contém os dNTPs, os primers e a enzima DNA polimerase,
misturados em uma solução tampão) toda essa mistura é colocada em um
termociclador, que faz ciclos de temperaturas pré-estabelecidos com tempos
exatos.
A PCR compreende três etapas, na
primeira etapa a temperatura é elevada da 94 a 96ºC por pouco tempo para que
haja a desnaturação (separação da dupla fita de DNA). Na segunda etapa é a
temperatura é reduzida entre 50 e 60ºC dependendo da quantidade de C e G
encontradas no primer, para que os primers se anelem com o DNA. A terceira e
última etapa a temperatura é elevada a 72ºC para que a enzima possa funcionar
sintetizando a nova molécula. Normalmente são realizadas de 20 a 40 ciclos para
cada reação na qual a taxa de replicação é exponencial (2ciclos).
Após o fim dos ciclos o DNA é
analisado através de uma eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida. A
eletroforese é uma técnica de separação de moléculas que envolve a migração de
partículas em um determinado gel durante a aplicação de uma diferença de
potencial, as moléculas são separadas de acordo com o seu tamanho, pois as de
menor massa irão migrar mais rapidamente que as de maior massa, além do tamanho
em alguns casos o formato da molécula também influi.
Após a aplicação em gel, é feita a
escolha conforme o tamanho da banda, a banda escolhida é submetida as técnicas
de RFLP (Polimorfismo no Comprimento de Fragmento de Restrição). Nesta técnica
é feita um tratamento do DNA com as enzimas de restrição (endonucleases), que
corta em um grande número de pontos (chamados de sítio de restrição), gerando
assim uma grande quantidade de fragmentos dependendo do tamanho do genoma. As
diferenças na seqüência de DNA das moscas resulta na clivagem de fragmentos de
tamanho distintos, que são separados através de eletroforese em gel de agarose.
As enzimas de restrição são
endonucleases que clivam o DNA em regiões específicas. Existem 3 tipos de
enzimas de restrição, as de Tipo I (corta o DNA aleatoriamente a 1000 pb do
sítio de especificidade), as de Tipo II (cortam no sítio de especificidade ou
perto dele), as de Tipo III (cortam a 24 – 26 pb 3’ do sítio de
especificidade). As enzimas tipo II são as mais usadas em engenharia genética
pelo fato de que seu padrão de clivagem é previsível e controlado. Eles
geralmente cortam regiões específicas dentro de tetra, penta ou
hexanucleotídios que tem um duplo eixo de simetria rotacional. Tais seqüências
são denominadas de palíndromos.
Com a clivagem do DNA e a formação
de diversos fragmentos de DNA com tamanho distintos, conseguimos diferenciar as
espécies, pois cada espécie tem uma disposição distinta. Mas somente fazendo a
leitura em gel de agarose não conseguimos visualizar essa diferença, para que
essa visualização ocorra, precisa-se efetuar a detecção dos marcadores
moleculares (RFLP), para isso é preciso transferir os fragmentos separados na
eletroforese para uma membrana de nylon, essa transferência é feita por
capilaridade utilizando um método denominado “Southern blot”. Nesta técnica a
membrana de nylon é posta sobre o gel, onde é feita uma pressão uniforme sobre
o gel (essa pressão pode ser feita utilizando uma pilha de papel toalha com um
peso em cima), isso faz com que o DNA passe do gel para a membrana, onde ele se
adere, esta por sua vez é exposta a radiação ultravioleta para ligar o DNA à
membrana permanentemente.
Para a revelação, isto é, para
visualizar essas porções é necessário fazer uma hibridização de pequenos
fragmentos clonados de DNA denominados “sondas”, com seqüências homólogas do
DNA imobilizando na membrana, assim somente os fragmentos fixados na membrana
que são homólogos ao DNA da sonda serão visualizados entre os milhares de
fragmentos resultantes do corte com enzimas de restrição. Para a preparação das
sondas incorporam-se nucleotídeos contendo moléculas de fósforo radioativos nos
fragmentos clonados do DNA. Após a hibridização com as sondas, a membrana é
exposta a filme de raio-x em um processo chamado de autoradiografia, revelando
as bandas que constituem os marcadores RFLP.
Como resultado, criam-se marcadores
específicos para cada espécie. O banco genômico será alimentado a cada espécie
caracterizada por PCR-RFLP.
A caracterização de marcadores
moleculares do DNAmt por meio de PCR-RFLP tem-se mostrado bastante eficiente na
identificação de insetos de importância forense. Pelo menos 18 espécies de
dípteros da família Calliphoridae já tem suas seqüências depositadas no
GenBank. No Brasil, estudos têm sido conduzidos com o fim de padronizar tais
técnicas para espécies de moscas brasileiras. A caracterização destes
marcadores podem contribuir não somente com a identificação de dípteras de
interesse forense, mas também contribuir significativamente para a resolução de
conflitos taxonômicos (para espécies com grande proximidade morfológica) assim
como possibilita uma rápida e eficiente identificação de insetos imaturos
(cujos caracteres morfológicos nem sempre são tão evidentes).
O banco genômico tem a característica
de ser de acesso público, em especial pela sociedade cientifica, onde poderá
ser ampliada não somente a parte das moscas, mais também poderão ser
adicionados características de mosquitos, e de outras ordens, como lepidópteras
e coleópteras, que são muito utilizadas para o mesmos fins. O acesso ao banco
além de inclusão de informações, poderão ser comprados kits com marcadores
moleculares para pesquisas e perícias criminais.
As perspectivas referente ao banco é
que ele seja “alimentando”, isto é, sejam acrescentados novos marcadores
moleculares e/ou sejam evoluídos os marcadores, e possam a ser confeccionados
os microarray (micro arranjos), produzindo assim chips que facilitaram o
trabalho dos cientistas e peritos, pois são menores e portáteis.
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