SEQUENCIAMENTO GENÉTICO - PARTE 1

PACINI, Diogo Barth. 

INTRODUÇÃO

No sitio do Papo Ciência (2010), encontramos a seguinte definição:

“O seqüenciamento é a técnica utilizada para determinar em que ordem as bases (letras) contidas no DNA, se encontram. Esta é apenas a primeira etapa de um processo cujo resultado final poderá resultar em novos métodos de diagnóstico, na formulação de novos medicamentos, vacinas, na prevenção e tratamentos mais eficazes contra doenças ou pragas.

O trabalho de seqüenciamento começa com a preparação das chamadas bibliotecas de DNA. Nessa fase, o genoma a ser mapeado é 'picotado' em inúmeros fragmentos. Esses pequenos trechos de DNA são então clonados, ou seja, cada trecho é ligado a uma estrutura que possui a capacidade de se multiplicar chamada plasmídeo. Estes plasmídeos são então inseridos em bactérias que são crescidas em meios específicos para multiplicação dos trechos originais do genoma em estudo.

Só após esse procedimento é iniciado o seqüenciamento do genoma propriamente dito. As bases do DNA são marcadas com cores diferentes e introduzidas no seqüenciador. Um feixe de raio laser, detecta precisamente em que ordem estão as bases nitrogenadas - adenina (A), citosina (C), guanina (G) e timina (T). Este procedimento possui inúmeras aplicabilidades, incluíndo testes de paternidade.

As técnicas de seqüenciamento têm evoluído consideravelmente, tornando o processo automatizado, mais rápido e acessível a um maior número de pesquisadores. No início dos anos 70, eram necessários dois anos para seqüenciamento de 20 bases de DNA. O processo era manual e envolvia o uso de material radioativo. Atualmente, com o desenvolvimento das técnicas de seqüenciamento automático, um aparelho de sequenciamento é capaz de seqüenciar meio milhão de pares de bases por dia.”

O INICIO DO SEQUENCIAMENTO

Desde a descoberta da dupla fita de DNA surgiram diversas ciências, entre elas a genética e a biologia molecular, ambas trabalham com o estudo dos genes, suas interações, a produção de proteína, com o intuito de se conhecer mais sobre o funcionamento de um organismo e/ou célula, além de conhecer possíveis doenças e tentar achar cura.

Para que isso fosse possível foi necessário descobrir várias técnicas, entre elas a de seqüenciamento genético. Onde por algumas metodologias fossem feitas várias cópias do gene de interesse e com isso se descubra as ordens das bases nitrogenadas.

Segundo MOLINA & TOBO (2004):

“As técnicas hoje utilizadas na genética molecular têm sido desenvolvida a partir da pesquisa acadêmica básica, em diferentes campos da atividade científica. O trabalho de Watson e Crick, em 1953, onde foi proposta a estrutura de dupla-fita do DNA, Marcou a revolução molecular.
Em 1975, Nathans e Smith purificaram enzimas de restrição, ferramentas essenciais para a manipulação in vitro do DNA. Estas foram de fundamental importância para o isolamento e amplificação de fragmentos específicos de DNA para a clonagem in vivo, tecnologia desenvolvida a partir das técnicas de DNA recombinante descritas por Berg em 1972. Tambem em 1975 uma nova metodologia, denominada Southern Blotting, começou a ser usada para investigar a localização de genes e marcou o início da aplicação destas tecnologias no estudo das doenças genéticas.
Em 1977, técnicas de seqüenciamento perimitiram a identificação de alterações específicas na sequência de DNA e a associação destas com diferentes doenças genéticas. Depois disso, o principal marco no desenvolvimento das técnicas de diagnóstico molecular foi a técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR), um método de clonagem in vitro proposto por Kary Mullis em 1987. (...)”

Existem basicamente dos tipos de métodos para o seqüenciamento do DNA, o primeiro método de seqüenciamento de DNA foi desenvolvido em meados dos anos 70 e ficou conhecido como seqüenciamento químico ou Maxam-Gilbert sequencing. O segundo método de seqüenciamento de DNA a ser desenvolvido ficou conhecido como seqüenciamento enzimático ou Sanger-Coulson sequencing. Embora o primeiro método tenha tido uma ampla aplicação inicialmente, o segundo método tornou-se mais reprodutível e utilizado ao longo das décadas (ZUKUROV, 2007).

Conforme Watson (2008) em seu livro DNA – O segredo da vida:

“(...)
... o progresso da biologia molecular na segunda metade dos anos 1970 não foi totalmente interrompido por questões políticas. Na realidade, fomos testemunhas nesses anos de vários avanços importantes, a maioria deles relacionada a ainda controvertida tecnologia de clonagem molecular de Boyer-Cohen. A descoberta mais significativa foi a invenção dos métodos de ler sequências de DNA. O seqüenciamento do DNA depende de haver uma grande quantidade disponível do trecho da molécula em que se está interessado; logo, não era algo exeqüível – exceto no caso dos pequenos DNAs dos vírus – antes que a tecnologia de clonagem fossem desenvolvidas. Como vimos, clonar em essência, significa inserir um pedaço desejado de DNA num plasmídeo, que por sua vez é inserido numa bactéria. As bactérias então se dividem e crescem, produzindo um enorme número de cópias do fragmento de DNA – que, ao serem extraídas das bactérias, fornecem uma grande quantidade do fragmento de DNA desejado, que pode então ser seqüenciado.

Duas técnicas de seqüenciamento foram desenvolvidas concomitantemente, uma por Wally Gilbert em Cambridge, Massachusetts (Harvard), e a outra por Fred Sanger em Cambridge, Inglaterra. O interesse de Gilbert pelo seqüenciamento de DNA surgiu quando ele isolou a proteína repressora do sistema regulador do gene da beta-galactosidase na E.coli. Como vimos, ele mostrara que a proteína repressora se liga ao DNA próximo do gene, impedindo-o de ser transcrito em cadeias de RNA. Agora Gilbert queria conhecer a sequência dessa região do DNA. Um encontro fortuito com o brilhante químico soviético Andrei Mirzabekov sugeriu-lhe uma maneira de usar certas combinações potentes de produtos químicos para romper as cadeias de DNA exatamente no sítio das bases em questão.

(...)

Contudo, dos dois métodos de seqüenciamento, foi o de Sanger que melhor superou o teste do tempo. Alguns dos produtos químicos necessários para quebrar o DNA do método de Gilbert são difíceis de usar; um mero descuido e podem começar a quebrar o DNA do próprio pesquisador. O Método de Sanger, por outro lado, utiliza a mesma enzima que copia DNA naturalmente nas células, a DNA polimerase. O truque era fazer a cópia a partir de pares de bases ligeiramente alterados. Em vez de usar apenas as bases “desoxi” (As, Ts, Gs e Cs) encontradas naturalmente no DNA (ácido desoxirribonucléico), Sanger acrescentou algumas bases ditas “didesoxi”, que possuem uma proximidade curiosa: a DNA polimerease não tem nenhuma dificuldade em incorporá-las na cadeia de DNA em crescimento (isto é, na cópia que está sendo produzida como complemento da fita-molde), mas em seguida não consegue acrescentar nenhuma outra base à cadeia. Em outras palavras, não há como uma cadeia duplicada por esse método estender-se para além de uma base didesoxi.

Imagine uma fita-molde cuja sequência seja GGCCTAGTA. Existem muitas, muitas cópias dessa feita no experimento. Imagine agora que essa fita esteja sendo copiada por meio da DNA polimerasena presença de uma mistura da A, T, G e C normais e também um pouco de A didesoxi. A enzima começará a copiar o DNA, acrescentando primeiro um C (correspondente ao G inicial), depois outro C, em seguida um G e então outro G. Mas, quando a enzima chega ao primeiro T, surgem duas possibilidades: acrescentar um A normal ou um A didesoxi à cadeia. Se incluir um A didesoxi, a fita não poderá continuar crescendo e o resultado será uma cadeia curta que termina em um A didesoxi (ddA): CCGGddA. No entanto, se incluir um A normal, então a DNA polimerase pode continuar acrescentando bases: T, C etc. A próxima chance de o A didesoxi provocar uma “parada” desse tipo só virá quando a enzima chegar ao T segueinte. Novamente aqui, ela poderá acrescentar um A normal ou um ddA. Se acrescentar um ddA, o resultado será outra cadeia truncada, embora um pouco mais comprida que a anterior, cuja a sequência será CCGGATCddA. E assim acontecerá cada vez que a enzima encontrar um T, ou seja, cada vez que tiver a ocasião de acrescentar um A à cadeia. Se, por acaso, um A normal for selecionado, a cadeia continuará; mas, sempre que um ddA for escolhido, a cadeia chega ao fim.

O que isso nos diz? No final desse experimentos, temos uma grande quantidade de cadeias de comprimentos variáveis, todas copiadas do molde de DNA. O que elas têm em comum? O fato de terminarem com um ddA.

Agora imagine o mesmo processo usando as três outras bases: no caso da T, por exemplo, podemos utilizar uma mistura de A, T, G e C normais mais DDT. As molecualas resultantes serão CCGGAddT ou CCGGATCAddT.

Depois de promover a reação das quatro maneiras possíveis – com ddA, ddT, ddG e ddC -, teremos quatro grupos de cadeias de DNA: uma composta de cadeias terminado em ddA, uma das cadeias terminando em ddT e assim por diante. Se agora conseguirmos classificar essas minicadeias de acordo com o comprimento de cada uma (que varia ligeiramente), poderemos inferir uma sequência. Como? Um momento, por favor. Primeiro, vejamos como seria possível efetuar uma triagem. Podemos colocar todos os fragmentos de DNA numa placa contendo um gel especial e colocar a placa sob um campo elétrico. Devido à atração desse campo elétrico, as moléculas de DNA serão forçadas a migrar pelo gel, e à velocidade com que determinada minicadeia avança de acordo com seu tamanho: cadeias curtas avançam mais depressa que cadeias longas. Após certo Intervalo de tempo, a menor minicadeia – no nosso caso, um simples ddC – terá percorrido uma distância ligeiramente menor; e o percurso da minicadeia subseqüente – CCddG – terá sido um pouco menor ainda. O truque de Sanger já deve ter ficado claro: ao ler as posições relativas de todas essas minicadeias após uma corrida cronometrada pelo gel, podemos inferir as sequências de nosso pedaço de DNA: primeiro teremos um C, depois outro C, um G em seguida, e assim por diante.

Em 1980, Sanger dividiu o prêmio Nobel de química com Gilbert e Paul Berg, que foi reconhecido por sua contribuição ao desenvolvimento das tecnologias do DNA recombinante. 

(...)”

REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)

De acordo com MOLINA & TOBO (2004):

“ A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma das técnicas mais empregadas nas diversas áreas do diagnóstico molecular. A sua introdução resultou em grande revolução tecnológica, permitindo a amplificação de uma sequência de interesse contida em uma amostra complexa de DNA e possibilitou a adoção de métodos automatizados para a análise do genoma. A tecnologia da reação em cadeia da polimerase também é bastante flexível, permitindo uma série de modificações que possibilitam o seu emprego na análise de uma grande variedade de amostras. 

Para a realização da PCR, utiliza-se uma enzima termoestável (DNA polimerase) que, na presença de um par de oligonucleotídeo iniciadores (primeres) e dos nucleotídeos que compõem a molécula de DNA, amplifica a região de interesse a partir de uma pequena quantidade de DNA. Esta amplificação ocorre durante repetidos ciclos de temperatura, a saber: 94ºC para desnaturação do DNA, 45ºC a 70ºC para hibridização dos oligonucleotídeos às sequências-alvo e 72ºC para a síntese do DNA, em um equipamento chamado de termocicladores. O DNA amplificado pode, então ser separado e visualizado em géis de agarose ou poliacrilamida e utilizado para diversos fins. 

Entre as principais técnicas resultantes de modificações da reação em cadeia da polimerase, podemos citar o RT-PCR, nested PCR, multiplex PCR, PCR a partir de primers randômicos e PCR em tempo real. O RT-PCR utiliza uma enzima chamada transcriptase reversa para converter uma amostra de RNA em cDNA antes da etapa de amplificação pro PCR, permitindo estudo de vírus de RNA e análise de expressão gênica. O nested PCR, que emprega uma segunda etapa de amplificação com um par de primers internos aos utilizados na primeira etapa e visa aumentar a sensibilidade e especificidade do método. Já PCR multiplex é uma reação de amplificação desenhada para detectar múltiplas sequências-alvo numa mesma amostra. PCR a partir de primers randômicos utiliza sequências curtas de oligonucleotideoas para amplificar regiões repetidas de DNA genômico e é bastante empregado em estudos epidemiológicos. Finalmente, PCR em tempo real permite que a amplificação e a detecção ocorram simultaneamente, num sistema fechado, sendo necessário para isto um termociclador que possua sistema de monitoramente de emissão de fluorescência. Estas técnicas é empregada para quantificação de amostras, como para testes de carga viral, e monitoramento de doença residual mínima.”

Ainda podemos acrescentar uma parte da apostila do Laboratório de Genética Funcional da USP (2001), que descreve a reação em cadeia da polimerase (PCR, Polymerase Chain Reaction), foi idealizada em meados de 1980 e totalmente descrita em 1987.

A maior aplicação desta metodologia é a possibilidade de se amplificar uma determinada sequência do DNA sem a necessidade do uso das tradicionais técnicas de clonagem molecular. Uma simples cópia de um gene específico dentro de um genoma pode ser amplificado para alguns microgramas, partindo-se de quantidades mínimas como sub picogramas de DNA total. A condição básica para a aplicação da técnica, depende da construção de oligonucleotídeos (iniciadores) os quais são complementares as duas fitas opostas do DNA e que estejam flanqueando a sequência a ser amplificada.

O processo inicia-se com a desnaturação da dupla fita do DNA que contém a sequência a ser amplificada. Geralmente, a desnaturação é realizada a uma temperatura de 94° C durante 5 minutos, onde nesta temperatura as duas fitas do DNA separam-se.

O passo seguinte, consiste em abaixar a temperatura para níveis ao redor de 35° C, permitindo que os oligonucleotídeos iniciadores anelem-se especificamente nas extremidades flanqueadas da sequência alvo e nas fitas opostas. Finalmente, a temperatura é elevada para aproximadamente 72° C e com isto a polimerase copia a sequência alvo a partir dos oligonucleotídeos iniciadores é a fase de extensão.

Inicialmente, usou-se a DNA polimerase da Escherichia coli, cuja temperatura ótima é de 37° C. Ela era adicionada manualmente a cada ciclo porque o passo de desnaturação a 94° C inativava a enzima.

Como podemos ver, o processo basicamente ocorre em 3 fases: desnaturação, anelamento e extensão, os quais, constituem um ciclo da reação de amplificação (Figura 35). Inicialmente, usou-se a DNA polimerase da Escherichia coli, cuja temperatura ótima é de 37° C. Ela era adicionada manualmente a cada ciclo porque o passo de desnaturação a 94° C inativava a enzima.

Um importante avanço técnico no processo surgiu com a descoberta da Taq polimerase (Sarki et al, 1988) oriunda da bactéria Thermus aquaticus a qual vive em fontes de água à temperatura de 75° C. A enzima tem uma temperatura ótima de ação a 72° C, mas permanece razoavelmente estável mesmo a 94° C e com isto, a enzima é adicionada uma única vez. Devido a este fato, foi possível a automatização do processo nos chamados termocicladores.

Além da molécula do DNA, também o RNA pode ser amplificado desde que ele seja primeiro convertido para cDNA através da transcrição reversa. Além do principal uso do PCR que é o processo de amplificação de sequências específicas, rapidamente surgiram novas aplicações para esta poderosa metodologia, tais como: sequenciamento de nucleotídeos, análise do polimorfismo, diagnóstico de doenças genéticas e infecciosas e várias outras aplicações mais específicas durante o uso da metodologia do DNA recombinante.”

Quando a técnica foi lançada ela apresentava diversas fatores que tornava muito trabalhoso, como por exemplo podemos citar a inexistência de um equipamento automatizador, como o termociclador (um equipamento elétrico que contém uma placa térmica e um sistema para aumentar e diminuir a temperatura interna rapidamente, e o tempo e as temperaturas dos ciclos são pré-programados), antigamente eram utilizados 3(Três) banhos-maria, com as devidas temperaturas (controladas por termômetros), e o tempo era controlada com um cronômetro, e o pesquisador (na verdade os estagiários) eram responsável por mudar a amostra de um banho-maria para outro por diversas vezes.

Segundo WATSON (2008), ... um grave problema inicial da reação em cadeia da polimerase, a enzima responsável pela multiplicação, é destruída a 95ºC. Por tanto, torna-se necessário obter enzimas novas em cada um dos 25 ciclos do processo. A polimerase é cara, de modo que logo ficou evidente que a sua reação em cadeia, por maior que fosse o potencial, não seria uma ferramenta economicamente viável se significasse “transformar em fumaça” enormes quantidades de material. Mas a natureza acabou dando uma mãozinha. Muitos organismos vivem em temperaturas muito superiores aos 37ºC ideais para a E.coli, a fonte original da enzima; as proteínas dessas criaturas, incluindo enzimas como a DNA polimerase, foram se adaptando ao longo de milênios de seleção natural para suportar o calor. Hoje, a reação em cadeia da polimerase costuma ser realizada usando uma forma de DNA polimerase derivada da Thermus aquaticus, uma bactéria que vive nas terma quentes do parque nacional Yellowstone.

RT-PCR

É uma reação da transcriptase reversa, seguida da reação em cadeia da polimerase . Não utiliza o DNA de cadeia dupla como molde e sim RNA de cadeia simples. A partir do RNA, a enzima transcriptase reversa sintetiza uma cadeia de DNA complementar (chamado agora de cDNA). Ao cDNA aplica-se a técnica de PCR. A técnica de RT-PCR é amplamente utilizada para verificar a expressão gênica, uma vez que analisa o RNA responsável pela síntese de proteínas. Se há uma proteína específica, é porque há DNA sendo expresso e originando mRNA para tal proteína. A expressão para produção de diferentes proteínas varia conforme a localização da célula dentro do organismo: células cardíacas expressam proteínas diferentes de células musculares, por exemplo (WIKIPÉDIA, 2010).

NESTED-PCR

É uma variação da reação em cadeia da polimerase (PCR), em que dois pares (ao invés de um par) de iniciadores da PCR são utilizados para amplificar um fragmento.O primeiro par de iniciadores da PCR amplifica um fragmento semelhante a um padrão de PCR. No entanto, um segundo par de primers chamados primers alinhados (como eles mentem / são alinhadas dentro do primeiro fragmento) vincular o primeiro fragmento do produto da PCR para permitir a ampliação de um segundo produto da PCR, que é mais curto do que o primeiro. A vantagem de Nested-PCR é que, se o fragmento da PCR foi amplificado errado, a probabilidade é muito baixa que a região seria amplificado pela segunda vez pelo segundo conjunto de primers (PCR STATIO, 2010) .

SOUTHERN BLOTTING

Southern blotting, recebeu o nome de Edward M. Sul que desenvolveu este procedimento na Universidade de Edimburgo na década de 1970. Para simplificar, as moléculas de DNA são transferidas de um gel de agarose para uma membrana. Southern blotting é projetado para localizar uma determinada seqüência de DNA dentro de uma mistura complexa. Por exemplo, borrar do sul poderia ser usado para localizar um gene específico dentro de um genoma inteiro. A quantidade de DNA necessário para esta técnica é dependente do tamanho e da atividade específica da sonda. Sondas curtas tendem a ser mais específico. Em condições ideais, pode-se esperar para detecção de 0,1 pg de DNA para que você está investigando (MAMA JI’S, 2010).

NORTHERN BLOTTING

Esta técnica utiliza o princípio da técnica southern blotting, entretanto não para detectar um segmento especifico de DNA, mais um segmento de uma molécula de RNA (RNAm e RNAr), sendo que esta técnica é amplamente utilizada para verificar a expressão celular. Os mesmos procedimentos utilizados para a técnica de southern blotting também se aplicam aqui, ou seja: extração de RNA, endonucleases de restrição, separação dos fragmentos com eletroforese, transferência para membrana de nylon, pré-hibridização e hibridização com sonda marcada radioativamente, com cor ou quimioluminescência para que sua visualização seja possível. Através desta técnica foi possível estudar a expressão gênica de células, bactérias, parasitas, fungos, plantas, etc... através da molécula de RNAm (RNA mensageiro) sintetizada durante o processo de transcrição (ZUKOROV, 2010).

WESTERN BLOTTING

Western blotting é uma técnica usada para identificar e localizar proteínas com base em sua capacidade de se ligar a anticorpos específicos. A análise ocidental do borrão pode detectar sua proteína de interesse de uma mistura de um grande número de proteínas. Western blot pode dar-lhe informações sobre o tamanho de sua proteína (com comparação com um marcador de tamanho ou escada em kDa), e também dar-lhe informações sobre expressão da proteína (com comparação com um controle, como amostra não tratada ou outro tipo de célula ou tecido). A análise ocidental do borrão pode analisar toda a amostra da proteína se das células ou tecidos, mas também pode analisar proteínas recombinantes sintetizadas in vitro. Borrão ocidental é dependente da qualidade do anticorpo usado para sondar para sua proteína de interesse, e como ele é específico para este anticorpos contra a proteína. são facilmente obtidos de fontes comerciais, e você pode comprar um para sua proteína de interesse. Se sua proteína é uma proteína da novela, você deve produzir um anticorpo se ou obter uma empresa para fazer isso por você. Neste caso, você precisará de pelo menos uma pequena quantidade de sua proteína purificada ou dos extratos da pilha ou feita como uma forma recombinante (ou seja, in vitro ou em um sistema de expressão de proteínas recombinantes). Anticorpos específicos para o seu proteínas são vitais para borrar ocidental como elas são vincular a possibilidade especificamente à sua proteína de interesse em vez dos milhares de proteínas em sua western blot (MOLECULAR STATION, 2010).

MULTIPLEX-PCR

É uma variante da PCR, que permite a amplificação simultânea de muitos alvos de interesse em uma reação usando mais de um par de primers. Desde sua primeira descrição em 1988 por Chamberlain et al, esse método foi aplicado em muitas áreas de testes de DNA, incluindo análises de deleções, mutações e polimorfismos, ou ensaios quantitativos e PCR de transcrição reversa. Normalmente, é utilizado para aplicações onde a genotipagem, análise simultânea de múltiplos marcadores é necessária, a detecção de patógenos ou organismos geneticamente modificados (OGM), ou por análise de microssatélites. Ensaios Multiplex pode ser tedioso e demorado para estabelecer, exigindo procedimentos de otimização demorado (PROTOCOL ONLINE, 2010) .

RFLP

Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP), é uma diferença de seqüências homólogas de DNA que pode ser detectada pela presença de fragmentos de diferentes comprimentos, após digestão das amostras de DNA em questão com endonucleases de restrição específicas. RFLP, como um marcador molecular, é específico para um único clone / combinação de enzimas de restrição. A maioria dos marcadores RFLP são co-dominantes (ambos os alelos na amostra heterozigótica será detectado) e altamente locus específico.Uma sonda de RFLP é uma seqüência de DNA marcado que cruza com um ou mais fragmentos da amostra de DNA digerido, depois eles são separados por eletroforese em gel, revelando um padrão único característico para borrar um genótipo específico em um locus específico. Curtas, simples ou de baixa cópia do DNA genômico ou cDNA clones são normalmente utilizados como sondas de RFLP. As sondas RFLP são freqüentemente usadas em mapeamento do genoma e na análise da variação (genotipagem, forense, testes de paternidade, diagnóstico de doenças hereditárias, etc.) (NCBI, 2010).

RAPD

Random Amplification Polymorphic DNA. É um tipo de reação de PCR, mas os segmentos de DNA que são amplificados são aleatórios. O cientista realizando RAPD cria vários primers curtos (8-12 nucleotídeos), prossegue com a PCR, utilizando um grande modelo de DNA genômico, esperando que amplificar os fragmentos. Resolvendo os padrões resultantes, um semi-perfil original pode ser adquirida a partir de uma reação de RAPD. Nenhum conhecimento da seqüência de DNA para o gene-alvo é necessário, como os iniciadores irá ligar em algum lugar na seqüência, mas não é certo exatamente onde. Isso torna o método popular para comparar o DNA dos sistemas biológicos que não tiveram a atenção da comunidade científica, ou em um sistema no qual as seqüências de DNA são relativamente poucas comparadas (que não é adequado para a formação de um banco de DNA). Porque ele mantém um grande modelo de seqüência de DNA intacto, tem algumas limitações no uso de amostras de DNA degradado. Seu poder de resolução é muito inferior ao previsto. Nos últimos anos, RAPD tem sido utilizada para caracterizar e traçar, a filogenia de diversas plantas e espécies animais (WIKIPÉDIA, 2010).

PCR EM TEMPO REAL

Segundo Pires-Alves & Novais (2004):

“(...) Ultimamente, uma inovação tecnológica resultante da PCR, denominada de PCR em Tempo Real, vem ganhando espaço nos diagnósticos clínicos e nos laboratórios de pesquisa por apresentar a capacidade de gerar resultados quantitativos. Essa técnica permite o acompanhamento da reação e a apresentação dos resultados de forma mais precisa e rápida, em relação à PCR que apresenta somente resultados qualitativos. 

A possibilidade de monitorar a PCR em tempo real revolucionou o processo de quantificação de fragmentos de DNA e RNA. A PCR em tempo real realiza a quantificação destes ácidos nucléicos de maneira precisa e com maior reprodutibilidade, por que determina valores durante a fase exponencial da reação. O ponto que detecta o ciclo na qual a reação atinge o limiar da fase exponencial é denominado de Cucle Thresbold. Este ponto permite a quantificação exata e reprodutível baseado na fluorescência. 

A emissão dos compostos fluorescentes gera um sinal que aumenta na proporção direta da quantidade de produto da PCR. Sendo assim, os valores da fluorescência são gravados durante cada ciclo e representam a quantidade de produto amplificado (http://www.ncifcrf.gov/rtp/gel/rtqpcr/whatis.asp, 2004). Os compostos fluorescentes mais utilizados são o SYBR® Green e TaqMan®. 

A PCR em tempo real requer uma plataforma de instrumentação que contém um termociclador com sistema ótico para a excitação da fluorescência e na coleção da emissão e um computador com um software para aquisição de dados e análise final da reação. Estas máquinas, disponíveis de diversos fabricantes, diferem na capacidade da amostra (96-poços padrão, processamento de poucas amostras ou requerem tubos capilares de vidro especializados), no método da excitação (lasers ou fontes claras do espectro largo com filtros ajustáveis), e na sensibilidade total. Há também diferenças nos software para o processamento dos dados (http://www.ambion.com/techlib/tn/81/813.html, 2004). 

Os fluoróforos são moléculas que absorvem e emitem luz em um comprimento de onda específico. Os sistemas de detecção da PCR em Tempo Real utilizam estas moléculas que proporcionam o acompanhamento da reação ao longo dos ciclos. 

O SYBR® Green se liga entre a fita dupla de DNA e com a excitação da luz emitida pelo sistema ótico do termociclador, emite uma fluorescências verde. As vantagens da utilização do SYBR® Green são: baixo custo, facilidade no uso e sensibilidade. A desvantagem é a ligação em todo DNA fita dupla que surge durante a reação, incluindo os dímeros dos iniciadores e outros produtos inespecíficos, podendo superestimar a concentração do fragmento alvo. O SYBR® Green não ligado ao DNA exibe uma fluorescência muito pequena. Entretanto, a fluorescência é realçada quando ligada na fita dupla do DNA. 

(...) 

As duas alternativas mais utilizadas além do SYBR® Green são TaqMan® e Molecular Beacons, ambos com capacidade de hibridização gerando transferência de energia para quantificação. 

TaqMan® é uma sonda (fragmento de DNA marcado usado para hibridizar outra molécula de DNA) utilizada para detectar sequências específicas nos fragmentos de DNA amplificados na PCR. Esta sonda apresenta em uma extremidade um fluoróforo, e na outra extremidade um quencher (molécula que aceita energia do fluoróforo na forma de luz e a dissipa na forma de luz ou calor). Os produtos da reação são detectados pela fluorescência gerada após a atividade exonuclease 5’ --> 3’ da Taq DNA polimerase. 

(...) 

A reação com a TaqMan® é considerada um método sensível para determinar a presença ou ausência de sequência específicas (HOLLAND et al., 1991). 

Molecular beacons são oligonucleotídeos usados como sondas de fita simples que formam uma estrutura secundária entre a extremidades 5’ e 3’, chamada de haste-e-loop. O loop contém uma sequência que é complementar à sequência-alvo e a haste é formada pelo anelamento das sequências complementares que estão localizadas nas extremidades. Um fluoróforo é covalentemente ligado no final de uma extremidade e um quencheré covalentemente ligado na outra extremidade. Os oligonucleotídeos molecular beacons não emite fluorescência quando estão livres em solução. Entretanto, quando hibridizam com a fita de DNA contendo a sequência-alvo, as sondas assumem uma mudança conformacional tornando-a capaz de emitir fluorescência. 

(...) 

Os molecular beacons podem ser sintetizados com diferentes cores de fluoróforos, possibilitando ensaioas que necessitam detectar diferentes alvos em uma mesma reação. São altamente específicos permitindo discriminar sequências-alvo que diferem entre si por apenas um nucleotídeo substituído. São sondas idéias, no ensaio diagnóstico para identificação genética, detecção de SNP (singlenucleotidepolymorfism) e aplicações farmacogenéticas (KRAMER,2004). 

O sistema de quantificação em tempo real tem as seguintes aplicações:

•  Identificação de alelos em DNA genômico;
•  Análise de sequências virais, bacterianas ou de protozoários a partir de várias fontes;
•  Análise de patógenos em alimentos;
•  Análise de produtos transgênicos;

A aplicação em diagnósticos, como a detecção de patógenos, ou doenças, torna-se interessante uma vez que esta técnica permite a quantificação e rapidez do resultado, pois não mais requer a detecção em gel de eletroforese, necessário na análise da PCR. 

(...)”

BIBLIOGRAFIA

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DIAS, Cristiane Kioko Shimabukuro. Sequenciamento de DNA: Métodos e princípios. Apresentação de Slides. Instituto de biociências, UNESP – Botucatu(SP);

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