FUNÇÃO HEPÁTICA E PANCREÁTICA

PACINI, Diogo Barth.

INTRODUÇÃO

            O fígado é o segundo maior órgão do corpo humano, perdendo somente para a pele. Está localizado abaixo do diafragma e ocupa a maior parte da região hipocôndrica direita e parte da região epigástrica, da cavidade abdominopélvica (TORTORA & GRABOWSKI, 2002).

O fígado tem como função a secreção da Bile e a metabolização dos carboidratos, lipídeos e proteínas; o processamento de fármacos e hormônios; excreção da bilirrubina; síntese dos sais biliares; ativação da vitamina D; fagocitose e o armazenamento de glicogênio, minerais e vitaminas. Devido a essa grande quantidade de função e importância para o corpo humano são solicitados provas de função hepática.

As provas de função hepática são um conjunto de exames laboratoriais pedidos pelo médico com o intuito de conferir se o fígado está funcionando normalmente (ZANLORENZI, 2014).

Dentre os exames temos, aminotransferase (TGP/ALT e TGO/AST), fosfatase alcalina, gama-GT e Bilirrubina (total, direta e indireta).

O pâncreas é uma glândula retroperitoneal que mede cerca de 12 a 15 cm de comprimento e 2,5 cm de espessura, situa-se atrás da curvatura maior do estômago.

A função do pâncreas é a secreção do suco pancreático, insulina, hormônios glucagon, somatostatina e poplipeptídios pancreáticos

No sitio da UFERSA (2014), encontramos os testes e função pancreática, que são, avaliação do pâncreas Endócrino (Glicemia, teste de tolerância à glicose, corpos cetônicos, hemoglobina glicosilada e insulina), e a avaliação do pâncreas exócrino (amilase e lipase, proteínas associadas à pancreatite, interleucina 6, polipeptídeo pancreático, tripsina e tripsinogênio, peptídeos ativadores do tripsinogênio, hiperlipemia, testes enzimáticos hepáticos, exame fecal, absorção de gordura e atividade da quimiotripsina pancreática – teste da bentiromida).

 

 FUNÇÃO HEPÁTICA

• TGO/AST

TGO – Transaminase Glutâmico Oxalacética;

AST – Aspartato aminotransferase.

            Valores de referência:

Homem: 15 a 40 U/L

Mulher: 13 a 35 U/L

                                                      

            Exame: Jejum de pelo menos 4 horas – coleta de sangue venoso.

            É uma enzima encontrada em altas concentrações no músculo cardíaco, músculos esqueléticos, hepatócitos e em menor escala no pâncreas e rins;  a dosagem sérica está limitada, atualmente, ao estudo das hepatopatias; quando aumentada é indicativo de hepatites virais agudas ou crônicas, hepatite por drogas, cirrose alcoólica, hemocromatose, icterícias hemolíticas e nos tumores primitivos ou metastáticos do fígado (CÂMARA, 2014).

            Em níveis elevados pode indicar infarto do miocárdio, hepatite aguda, mononucleose infecciosa, infiltração hepática por linfoma e leucemia, cirrose hepática, pancreatite aguda, entre outros; quando seu nível diminui pode representar má nutrição, deficiência de vitamina B6, uso de contraceptivos orais ou falência renal (TGO – IG Saúde, 2014)

• TGP/ALT

TGP – Transaminase Glutâmico Pirúvica;

ALT – Alanina aminotransferase.

            Valores de referência:

Homem: 10 a 40 U/L

Mulher: 7 a 35 U/L

            Exame: Jejum de 8 horas – coleta de sangue venoso.

            É uma enzima encontrada praticamente apenas em células do fígado, portanto, é mais específica do que a enzima TGO/AST, que podem ser encontradas também em outros órgãos do corpo; o TGP/ALT serve para investigação das funções hepáticas e de hepatites virais, cirrose, insuficiência cardíaca, isquemia do fígado e câncer do fígado (TGP – IG Saúde, 2014).

•  BILIRRUBINA

A Bilirrubina é uma substância proveniente do metabolismo de células velhas do sangue (hemácias) e é responsável por ajudar na digestão de gordura; Está presente em duas formas no corpo: indireta (ou não conjugada) e direta (ou conjugada); A forma indireta esta presente no sangue enquanto a forma direta já passou pelo fígado (já foi conjugada) e esta pronta para atuar na digestão; pode ser dosada na forma total (indireta + direta) ou separadamente (ZANLORENZI, 2014).

O teste de bilirrubina pode ser feito no sangue e na urina. Quando se detecta bilirrubina na urina é sinal de icterícia.

            Para o exame de sangue (coleta do sangue venoso), é necessário para o adulto um jejum de 4 a 12 horas e para criança ou recém-nascido não necessita de jejum. Os valores de referência para exames de sangue são:

Adulto: igual ou inferior a 1.2 mg/dl (Bilirrubina Total);

              igual ou inferior a 0,8 mg/dl (Bilirrubina Indireta);

              igual ou inferior a 0,2 mg/dl (Bilirrubina Direta);

Criança: 1 a 2 mg/dl (Bilirrubina Total);

Recém-Nascidos (Bilirrubina Total): 1 dia – 1 a 8 mg/dl;       

                                                                2 dias – 6 a 12 mg/dl;

                                                                3 – 5 dias – 4 a 8 mg/dl.

            Segundo o sitio Hepcentro (2014), os termos “direta” e “indireta” referem-se ao método criado para diferenciá-las por van der Bergh e Muller em 1916, mas que persistem até hoje (gerando confusão desnecessária); o aumento da bilirrubina indireta, portanto, é causado pelo aumento da degradação do heme ou deficiência da conjugação no fígado; o aumento da bilirrubina direta é causado principalmente por deficiência na eliminação da bilirrubina pela bile; o aumento de ambas pode ser causado por obstrução no fluxo de bile (mas com predomínio do aumento da bilirrubina direta) ou por lesão mais intensa dos hepatócitos (onde há deficiência na conjugação e também refluxo da bilirrubina conjugada para o sangue); assim, a dosagem das bilirrubinas é um exame que pode avaliar ao mesmo tempo lesão hepatocelular, fluxo biliar e função de síntese do fígado.

            Conforme exemplificado no sitio Bioinforme (2014), a causa do aumento da bilirrubina conjugada (direta) são, falha na excreção da bilirrubina conjugada (síndrome de Dubin-Johnson, síndrome de Rotor), disfunção hepatocelular (hepatite, cirrose hepática, colestase intra-hepática (drogas, cirrose biliar, sepse, pós-operatórios), mononuclease, colangite, sarcoidose, linfomas), obstrução biliar (coledocolitíse, atresia biliar, carcinoma (vias biliares, fígado ou pâncreas), verminose (Ascaris lumbicoides), abscessos, pancreatite, doenças congênitas das vias biliares); e as causas do aumento da bilirrubina não-conjugada (indireta) são, aumento da oferta (reação transfusional, anemia hemolíticas (auto-imune, hemoglobinopatias, drogas), infecções virais e bacterianas, queimaduras, reabsorção de hematomas, infarto pulmonar), alteração no transporte (mecanismos de competição de drogas pelo sitio de ligação da albumina, acidose metabólica, hipoalbuminemia), redução da captação (contrastes radiológicos, distúrbios transitório após hepatite, imaturidade neonatal e alguns casos de síndrome de Gilbert), alteração na conjugação (deficiência total ou parcial da enzima glicuroniltransferase (síndrome de Gilbert, Crigler-Najjar tipo I e II), imaturidade neonatal, síndrome de Lucey-Driscoll).

           

•  FOSFATASE ALCALINA/FAL

Enzimas distribuídas por diversas partes do corpo como fígado, intestinos, ossos, rins, placenta, entre outros; seus valores normais são altamente dependente da idade e sexo do paciente, sendo mais alto em idosos, crianças e gestantes; por estar presente em tantas partes do corpo, é necessária a dosagem de uma segunda enzima para confirmar que se aumento ou diminuição vem do fígado, é a Gama-GT (ZANLORENZI, 2014)

     No fígado, a fosfatase alcalina está localizada na membrana celular que une a borda sinusoidal das células parenquimais aos canalículos biliares; os níveis séricos de fosfatase alcalina são de grande significado na investigação das desordens hepatobiliares e o nível elevado são encontrados predominantemente, na obstrução extra-hepática (cálculo vesicular, câncer de cabeça do pâncreas) e na obstrução do trato biliar (CÂMARA, 2014).

            Os valores diminuídos são encontrados em hipotireoidismos, escorbuto, cretinismo e acondroplasia (EXAMES DE ROTINA, 2014).

            Segundo dados do Hepcentro (2014), os valores normais varia de acordo com a idade: 1 dia de idade: até 250 U/L; 2 - 5 dias: até 231 U/L; 6 dias - 6 meses: até 449 U/L; 7 meses - 1 ano: até 462 U/L; 2 - 3 anos: até 281 U/L; 4 - 6 anos: até 269 U/L; 7 - 12 anos: até 300 U/L; 13 - 17 anos: até 187 U/L (mulheres) e 390 U/L (homens); adultos: 35 a 104 U/L (mulheres) e 40 a 129 U/L (homens).

•  GAMA-GT

A Gama-glutamiltransferase catalisa a transferência de um grupo gama-glutamil de um peptídio para outro peptídio ou para um aminoácido produzindo aminoácidos gama glutamil e cistenilglicina; está envolvida no transporte de aminoácidos e peptídios através das membranas celulares, na síntese protéica e na regulação dos níveis de glutatião tecidual; Gama-GT é encontrada no fígado, rim, intestino, próstata, pâncreas, cérebro e coração (CÂMARA, 2014).

Indicador sensível de doença do fígado, porém, é pouco específico: seu aumento possivelmente significa doença, porém, podem estar aumentado em outras situações que não doenças hepáticas, por isso, deve ser analisado junto com os outros resultados; algumas literaturas indicam que apenas Gama-GT isolada indica alcoolismo,  o que não é verdade, pode estar alta após um infarto miocárdico, doença pancreática ou pulmonar, diabetes, entre outros (ZANLORENZI, 2014).

O sitio Hepcentro (2014) informa que os valores normais são: 8 a 41 U/L (mulheres e 12 a 73 U/L (homens).

Os valores aumentados ocorrem em hepatites, cirrose hepática, tumores hepáticos e uso de drogas hepatotóxicas; algumas drogas/medicamentos podem aumentar ou reduzir os valores de Gama-GT (EXAMES DE ROTINA, 2014), por isso é necessário informar o uso de medicamentos no momento de realizar o cadastro para o exame.

 FUNÇÃO PANCREÁTICA

•  AMILASE

A amilase é uma enzima produzida pelo pâncreas e pelas glândulas salivares, que atua na digestão do amido e do glicogênio contidos nos alimentos. Clinicamente, sua análise é um indicador útil no diagnóstico da pancreatite e de paratiroidites, por exemplo (ZANIN, 2014)

.

Segundo, Câmara (2014), a amilase sérica é secretada, fundamentalmente, pelas glândulas salivares (forma S) e células acinares do pâncreas (forma P). É secretada no trato intestinal por meio do ducto pancreático. As glândulas salivares secretam a amilase que inicia a hidrólise do amido presente nos alimentos na boca e esôfago. Esta ação é desativada pelo conteúdo ácido do estômago. No intestino, a ação da amilase pancreática é favorecida pelo meio alcalino presente no duodeno. A atividade amilásica é também encontrada no sêmem, testículos, ovários, tubos de Fallopio, músculo estriado, pulmões e tecido adiposo. A amilase tem massa molecular entre 40.000 e 50.000 daltons sendo, facilmente, filtrada pelo glomérulo renal.

Conforme o sitio Boa Saúde no Link Exames de rotina (2014), a amilase pode ser dosada na urina e no sangue. No exame de urina a finalidade é o diagnóstico de pancreatite aguda ou inflamação de glândulas salivares, avaliação da função do pâncreas e das glândulas salivares, quanto aos valores normais depende do laboratório, pois variam de laboratório para laboratório e segundo o método utilizado, em valores aumentados podem podem significar pancreatite aguda, patologia da vesícula, carcinoma de cabeça de pâncreas, caxumba, acometimento do baço, obstrução do ducto pancreático ou ducto salivar, patologia renal e em caso de valores diminuídos podem significar: alcoolismo, caquexia, hepatite, abscesso hepático, cirrose, câncer de fígado. No exame de Sangue a finalidade é o diagnóstico de lesão pancreática, pancreatite e um diagnóstico diferencial entre a pancreatite e outras causas de dores abdominais aguda; os valores normais é de 60 a 180 unidades Somogei x dl; os valores elevados podem ocorrer em Doença aguda das glândulas salivares, pancreatite aguda, obstrução da ampola de Vater, obstrução do conduto biliar comum, câncer de pâncreas, patologia pancreática por lesão ulcerosa péptica; e em caso de valores diminuídos podem significar cirrose, hepatite, câncer pancreático, toxemia gravídica.

•  LIPASE

Segundo Câmara (2014), A lipase é uma enzima altamente específica que catalisa a hidrólise dos ésteres de glicerol de ácidos graxos de cadeia longa (triglicerídeos) em presença de sais biliares e um cofator chamado colipase. As ligações éster, nos átomos de carbono 1 e 3 são preferentemente rompidas, produzindo dois mol de ácidos graxos de cadeia longa e um mol de 2-acilmonoglicerídio por mol de triglicerídeo hidrolisado. Tanto a lipase como a colipase são sintetizadas pelas células acinares do pâncreas. A lipase também é encontrada na mucosa intestinal, leucócitos, células do tecido adiposo, língua e leite. E como significado clínico a lipase é um marcador mais específico de doença pancreática aguda do que a amilase. Seus níveis estão aumentados em pacientes com pancreatite aguda e recorrente, abscesso ou pseudocisto pancreático, trauma, carcinoma de pâncreas, obstrução dos ductos pancreáticos e no uso de fármacos (opiáceos). Está também aumentada na maior parte das condições inflarmatórias da cavidade abdominal, doenças do trato biliar, abscessos abdominais e insuficiência renal aguda e crônica (com menor frequência do que a amilase).

Em exame laboratorial o valor de referência é até 60 U/L, pode ocorrer valores aumentados em caso de pancreatite aguda, câncer pancreático, hemodiálise, colecistite, hemorragia intracraniana, afecções hepáticas, como certas icterícias e cirrose hepática, úlcera duodenal e gastroenterite viral, algumas medicações também podem alterar os valores por isso deve ser informado o uso de medicamentos (EXAMES DE ROTINA, 2014).

REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA

BIOINFORME. Sérgio Franco Medicina Diagnóstica. Disponível em: http://www.sergiofranco.com.br/bioinforme/index.asp?cs=Bioquimica&ps=bilirrubinasSericas. Acesso em: Junho de 2014.

CÂMARA, Brunno. Enzimas de diagnóstico. Disponível em: http://www.biomedicinapadrao.com/2011/12/enzimas-de-diagnostico.html . Acesso em: Junho de 2014.

EXAMES DE ROTINA. Amilase na Urina (código AMB (antigo): 2.80.10.25-6). Disponível em: < http://www.boasaude.com.br/exames-de-rotina/b/19/view/bilirrubina-na-urina-codigo-amb-4031100-7.html >. Acesso em: Junho de 2014.

EXAMES DE ROTINA. Amilase no sangue (código AMB: Amilase 4.03.01.28-1 / Amiase ou alfa-amilase, isoenzimas 4.03.02.13-0). Disponível em: < http://www.boasaude.com.br/exames-de-rotina/a/7/view/amilase-no-sangue-codigo-amb-amilase-4030128-1-amilase-ou-alfa-amilase-isoenzimas-4030213-0.html >. Acesso em: Junho de 2014.

EXAMES DE ROTINA. Bilirrubina na urina (código AMB: 4.03.11.00-7). Disponível em: < http://www.boasaude.com.br/exames-de-rotina/a/6/view/amilase-na-urina-codigo-amb-antigo-2801025-6.html >. Acesso em: Junho de 2014.

EXAMES DE ROTINA. Bilirrubina no sangue (código AMB: Bilirrubinas (direta,indireta e total) 4.03.01.39-7 / Provas de função hepática (bilirrubinas,eletroforese de proteínas. FA, TGO, TGP e Gama-PGT) 4.03.12.15-1). Disponível em: < http://www.boasaude.com.br/exames-de-rotina/b/20/view/bilirrubina-no-sangue-codigo-amb-bilirrubinas-direta-indireta-e-total-4030139-7-provas-de-funcao-hepatica-bilirrubinas-eletroforese-de-proteinas-fa-tgo-tgp-e-gama-pgt-4031215-1.html >. Acesso em: Junho de 2014.

EXAMES DE ROTINA. Fosfatase alcalina (código AMB: 4.03.01.88-5). Disponível em: < http://www.boasaude.com.br/exames-de-rotina/f/54/view/fosfatase-alcalina-codigo-amb-4030188-5.html>. Acesso em: Junho de 2014.

EXAMES DE ROTINA. Gama-glutamil transferase – GGT (código da AMB 4.03.01.99-0). Disponível em: < http://www.boasaude.com.br/exames-de-rotina/g/130/view/gama-glutamil-transferase-x-ggt-codigo-da-amb-4030199-0.html>. Acesso em: Junho de 2014.

EXAMES DE ROTINA. Transaminase oxalacética – TGO (código da AMB 4.03.02.50-4). Disponível em: < http://www.boasaude.com.br/exames-de-rotina/t/153/view/transaminase-oxalacetica-x-tgo-codigo-da-amb-4030250-4.html>. Acesso em: Junho de 2014.

EXAMES DE ROTINA. Transaminase Pirúvica – TGP (código da AMB 4.03.02.51-2). Disponível em: < http://www.boasaude.com.br/exames-de-rotina/t/154/view/transaminase-piruvica-x-tgp-codigo-da-amb-4030251-2.html >. Acesso em: Junho de 2014.

HEPCENTRO. Disponível em: < http://www.hepcentro.com.br/exames.htm >. Acesso em: Junho de 2014.

MINCIS, Moysés; MINCIS, Ricardo. Enzimas hepáticas: aspectos de interesse prático. Disponível em: < http://www.moreirajr.com.br/revistas.asp?fase=r003&id_materia=3250 >. Acesso em: Junho de 2014.

TORTORA, Gerard J.; GRABOWSKI, Sandra Reynolds. Princípios de Anatomia e Fisiologia. 9ª ed. Guanabara Koogan. Rio de Janeiro, 2002.

TGO – IG Saúde. Disponível em: < http://saude.ig.com.br/minhasaude/exames/transaminase+glutamico+oxalacetica+tgo/ref1237835316884.html>. Acesso em: Junho de 2014.

TGP – IG Saúde. Disponível em: < http://saude.ig.com.br/minhasaude/exames/transaminase+glutamico+piruvica+tgp/ref1237835339996.html >. Acesso em: Junho de 2014.

UFERSA. Universidade federal rural do semi-árido. Disponível em: < http://www2.ufersa.edu.br/portal/view/uploads/setores/181/arquivos/Fun%C3%A7%C3%A3o_Pancre%C3%A1tica.pdf >. Acesso em: Junho de 2014.

ZANLORENZI, Alexandre. Provas de Função Hepática. Disponível em: < http://medsimples.com/provas-de-funcao-hepatica/ >. Aceso em: Junho de 2014.

ZANIN, Tatiana. Amilase. Disponível em: < http://www.tuasaude.com/amilase/ >. Acesso em: Junho de 2014.

EPIDEMIA: PLANO DE CONTROLE E COMBATE A LEPTOSPIROSE

PACINI, Diogo Barth

A Leptospirose é uma doença infecciosa causada por bactéria, em especial a mais conhecida é a bactéria Leptospira interrogans, apesar de ser a mais conhecida a leptospirose pode ser causada por outras bactérias da mesma família (L. kirschneri, L. noguchii, L. alexanderi, L. weilii, L. borgpetersenii, L. santarosai, L. kmety) além dessas bactérias causadoras, temos as oportunistas, isso é, não causam leptospirose em organismos sadios, mas se aproveitam de organismos debilitados, são elas: L. inadai, L. fainei, L. broomii, L. licerasiae, L. wolffii. Devido a essa grande quantidade de bactérias causadora da mesma doença é comum encontrar nos registros como Leptospira patogênica, visto que além destas citadas existem as que não causam doenças. A Leptospirose também é uma zoonose, isso é, causa doença em animais e os animais transmitem essa doença para o homem. O Ser Humano é considerado hospedeiro terminal da leptospirose, visto que é muito rara a transmissão entre os seres humanos (devido a essa raridade, não são encontrados na literatura dados deste tipo de transmissão), a transmissão e feito de animal para animal e de animal para seres humanos.

O rato é o maior e mais conhecido transmissor de leptospirose, mas outros animais, tais como, bovinos, suínos, equinos, caprinos, ovinos e caninos também são reserva natural da bactéria Leptospira e transmissores de leptospirose.

A leptospirose também pode ser considerada uma doença ocupacional visto que atinge trabalhadores rurais e também pessoas que trabalham em rede de tratamento de água e esgoto.

O Brasil é um país endêmico de leptospirose com ocorrência de epidemias anuais, devido ao grande numero de cidades sem tratamento de esgoto e as grandes inundações e as enchentes que ocorrem todo o ano.

Os primeiros sintomas da leptospirose são muito comum a outras doenças, tais como dengue, gripe e outras doenças tropicais, dentre os sintomas estão, febre alta, cefaleia, náuseas, vômitos, tosse, diarreias, dores muscular (principalmente de membros inferiores), entre outros, o que diferencia a leptospirose das demais doenças é a hiperemia conjuntival (alergia nos olhos). Existem duas fases, a fase precoce e a fase tardia.

A Fase precoce ou fase leptospirêmica, é a fase onde são encontrados os primeiros sintomas, por isso, a doença é branda e mais fácil de controlar. A fase tardia ou fase imune é a fase onde a doença é mais severa e pode levar a óbito se não tratado com urgência, nesta fase ocorre a síndrome de Weil (Adolf Weil – nome do patologista que descobriu e descreveu a leptospirose), nesta síndrome é caracterizada por hemorragias (mais comum é a hemorragia pulmonar), icterícia (a pele fica em um tom amarelo-alaranjado), e insuficiência renal (devido a bactéria paralisar as funções do rim)

.

O Tratamento médico é feito com antibióticos, na fase precoce o paciente é tratado em casa, onde o médico receita um antibiótico e a hidratação do paciente, já a fase tardia por ser mais severa, o paciente fica internado e recebe o antibiótico e a hidratação de meio venoso. Não é aconselhado em nenhuma das fases o uso de medicamento que contenha ácido acetilsalicílico, pois esse pode aumentar o risco de sangramento/hemorragia. Não existem vacinas contra leptospirose para humanos, somente para animais, mas a vacina não impede que o animal contraia a bactéria, a vacina somente evita que os animais contraiam a doença (leptospirose), mesmo assim eles são transmissores da doença.

Quando as pessoas forem ao posto de saúde com sintomas de leptospirose o posto tem por obrigação legal, avisar o departamento de vigilância da saúde e ambiental da secretaria de saúde. Que por sua vez da o suporte necessário junto ao posto, com treinamento da equipe de médicos, enfermeiros e técnicos.

Uma das ações que podem ser tomadas é a distribuição de folhetos informativos sobre a doença e dicas de higiene pessoal e sugestão para limpeza dos terrenos e residências, e a mesma informação ser divulgada por meio do rádio e televisão.

Se mesmo com essas ações continuar aumentando o numero de casos de pessoas infectadas com leptospirose, a secretaria de saúde é obrigada a informar o Ministério da saúde, e passa assim a ser considerado uma epidemia, visto que uma região inteira esta com surto, e corre o risco de passar para regiões adjacentes.

Outro meio de controle da Leptospirose é realizar a desratização, intensificar a coleta de lixo, realizar a limpeza de bocas de lobo, limpeza das vias públicas e intensificar o serviço de cata-entulhos.

A leptospirose é diagnosticada com exames físicos, clínicos e laboratoriais, que os médicos solicitam ao laboratório credenciado. Inicialmente os médicos aferem a pressão arterial e a temperatura, observam os estado de hidratação, observam se não há sangramento, avaliam o nível de consciência do paciente e a presença de icterícia. Os exames laboratoriais que são sugeridos são hemograma completo, e bioquímico (ureia, creatinina, bilirrubina, TGO, TGP, gama-GT, fosfatase alcalina, CPK, Na+ e K+), se o médico achar necessário ou suspeitar que o paciente já esteja na fase imune da doença ele solicita a radiografia do tórax, o eletrocardiograma (ECG) e a gasometria arterial.

Os sinais clínicos que sugerem uma internação imediata são: Icterícia, arritmias, hipotensão, fenômenos hemorrágico, oligúria, dispneia, tosse, taquipnéia, vômitos frequentes e alteração no nível de consciência, para internação basta ocorrer um desses sintomas.

Mesmo identificando os sintomas, e conferindo os exames o médico pode solicitar o exame de cultura bacteriana (cultura de bactéria especifica (leptospira) e geral), além do PCR para identificação da espécie da bactéria através do DNA.

Conforme dito anteriormente, independente da fase, o tratamento é feito com antibiótico e hidratação. No caso da internação, as primeiras 24 horas são as mais críticas, pois é neste período que o paciente pode vir a óbito.

Após o combate ao transmissor da leptospirose, através de desratização, conscientização e da limpeza urbana, o controle é feito pelo sistema de saúde, com distribuição de antibióticos, orientação e internação.

Por isso, e por causa de outras doenças devemos sempre manter os terrenos e as vias públicas limpas, realizar a separação do lixo para facilitar a coleta seletiva e evitarmos armazenar caixas de papelão, papéis e demais entulhos dentro das residências e dos terrenos.

BIBLIOGRAFIA CONSULTADA:

BRASIL. Guia Leptospirose: diagnóstico e Manejo Clínico/ Ministério da Saúde, Secretaria de Vigilância em Saúde, 2009.

CIVES (UFRJ) - http://www.cives.ufrj.br/informacao/leptospirose/lep-iv.html

Laboratório Fleury - http://www.fleury.com.br/revista/dicionarios/doencas/pages/leptospirose.aspx

LIMA, S. C. de; SAKATA, E. E.; ROCHA SANTO, C. E. da; YASUDA, P. H.; STILIANO, S. V. & RIBEIRO, F. A. – Surto de leptospirose humana por atividade recreacional no Município de São José dos Campos, São Paulo. Estudo soroepidemiológico. Rev.Inst. Med. Trop. São Paulo. 32 (6): 474-479, novembro-dezembro, 1990

Revista Viva a Saúde - http://revistavivasaude.uol.com.br/Edicoes/32/artigo30660-1.asp/

SEQUENCIAMENTO GENÉTICO - PARTE 2

PACINI, Diogo Barth. 

SEQUENCIAMENTO AUTOMÁTICO

No Livro DNA – O segredo da vida, de James Watson (2008), temos que:

(...) 

A reação em cadeia da polimerase logo se tornou um dos principais burros de carga do Projeto Genoma Humano. O processo é basicamente idêntico ao desenvolvido por Mullis, mas foi automatizado. Já não dependemos de legiões de universitários tresnoitados para realizar a exaustiva transferência de minúsculas quantidades de fluidos par tubos plásticos, pois um moderno laboratório genômico possui linhas de produção controladas por robôs. Num projeto do porte do seqüenciamento do genoma humano, é inevitável que as máquinas que produzem a reação em cadeia da polimerase preparem enormes quantidades de enzimas polimerase resistente ao calor. Por isso, os cientistas do Projeto Genoma Humano ficaram indignados com os polpudos royalties acrescentados ao custo da enzima pelo detentor da patente do processo, o gigantesco complexo industrial-farmacêutico europeu Hoffmann-LaRoche. 

Outro burro de carga foi o próprio método de seqüenciar DNA. Também aqui, a teoria química subjacente não era nova; o Projeto Genoma Humano usou o mesmo método desenvolvido por Fred Sanger em meados dos anos 1970. A inovação estava na escala, na mecanização do processo de seqüenciamento. 

A automação do seqüenciamento começou a ser desenvolvida no laboratório de Lee Hood, no Caltech. Em seus dias de jogador de futebol americano num colégio em Montana, Hood fez com que seu time ganhasse sucessivos campeonatos estaduais e levaria consigo a academia tudo o que aprendera sob trabalhar em equipe. Seu laboratório congregava uma mistura eclética de químicos, biólogos e engenheiros, e logo se tornou um dos lideres em inovação tecnológica. 

Na verdade, o seqüenciamento automatizado nasceu das idéias de Lloyd Smith e Mike Hunkapiller. Quando trabalhava no laboratório de Hood, Hunkapiller procurou Smith para falar sobre o método de seqüenciamento que usava um corante diferente para cada tipo de base. Em principio, a idéia prometia tornar o processo de Sanger quatro vezes mais eficiente: em vez de quatro reações de seqüenciamento separadas, cada uma das banda do gel distinta, o código de cores permitiria realizar tudo num único conjunto de reações e ober um resultado numa única banda de gel. Smith mostrou-se inicialmente pessimista, temendo que as quantidades de corantes especiais que ficam fluorescentes sob raios laser. 

Segundo o método-padrão de Sanger, cria-se uma série de fragmentos de DNA, que são selecionados pelo gel de acordo com o tamanho de cada um. Cada fragmento é “etiquetado” com um corante fluorescente que corresponde ao seu nucleotídeo didesoxi demarcador da cadeia; desse modo, a cor emitida pelo fragmento identifica qual é a base. Em seguida, um laser rastreia o fundo do gel, ativando a fluorescência, e uma célula fotoelétrica ali colocadas diretamente num computador, evitando-se assim o martirizante processo de digitar dados que transtornava o seqüenciamento manual. 

Hunkapiller deixou o laboratório de Hood em 1983 e fooi trabalhar para a Applied Biosystem, INC. (ABI), uma fabricante de instrumento que acabara de ser fundada e que produziria a primeira máquina de seqüenciamento Smith-Hunkapiller. Desde então, a eficiência do processo aumentou imensamente: os géis (lentos e difíceis de manusear) foram descartados e substituídos por sistemas capilares de grande vazão – finíssimos tubos nos quais os fragmentos de DNA são separados em alta velocidade de acordo com o tamanho. Hoje, a última geração de seqüenciadores da ABI é de uma rapidez descomunal, sendo alguns milhares de vezes mais ágeis do que o protótipo. Com um mínimo de intervenção humana (cerca de quinze minutos a cada 24 horas), essas máquinas conseguem seqüenciar até meio milhão de pares de base por dia. Em última análise, foi essa tecnologia que viabilizou o Projeto Genoma Humano. 

(...)

O desenvolvimento e a utilização de seqüenciadores automáticos tornaram mais rápido e eficiente os seqüenciamento de DNA na medida em que as etapas de leitura do gel e o processamento de sequências são realizados através de computadores. Assim, o surgimento e a utilização de seqüenciadores automáricos foi o maior benefício alcançado com o desenvolvimento da técnica. Em concordância com as técnicas manuais, a reação de seqüenciamento é também realizada através do método de Sanger. Entretanto, devido aos ddNTPs serem marcados com fluoróforos ou invés de isótopos radioativos, os fragmentos de DNA são detectados através de fluorescência induzida a laser. Quando diferentes fluoróforos são empregados e uma vez excitados por um feixe de laser emitem luz em diferentes comprimento de onda. É possível marcar com estes fluoróforos o primer universal M13mp ou então, cada um dos ddNTPs. Assim, uma vez que em cada uma das reações foi empregado um fluoróforo diferente é possível juntar estes produtos numa só reação e realizar a corrida em uma única raia do gel de seqüenciamento. Os produtos da reação de seqüenciamento, marcados com os fluorocromos, ao serem submentidos à eletroforese passam pelo feixe de laser, que promove a excitação dos fluorocromos. A luz emitida pelos fluoróforos é detectada por um fotomultiplicador e a informação é processada através de um computador (CARUSO, 2007).

A utilização de sequenciadores automáticos é essencial quando deseja-se realizar sequenciamneto em larga escala, como por exemplo em projetos genoma. O desenvolvimento e utilização de sequenciadores automáticos torna mais efeciente e rápido o sequenciamento de DNA na medida em que as etapas de leitura do gel e o processamento de sequências são realizadas através de computadores. A reação de sequenciamento é realizada através do método de Sanger (1979), do mesmo modo que no sequenciamento manual. Entretanto, no sequenciamento automático os nucleotídeos estão marcados com fluorocromos ao invés de isótopos radioativos. Quatro diferentes fluorocromos são empregados e uma vez excitados por um feixe de laser emitem luz em diferentes comprimentos de onda. É possível marcar com estes fluorocromos o "primer" universal M13 ou então cada um dos dideoxinucleotídeos (terminadores). Assim, uma vez que em cada uma das reações (A, T, C, G) foi empregado um fluorocromo diferente é possível juntar estes produtos e realizar a corrida em uma única raia do gel de sequenciamento. Os produtos da reação de sequenciamento, marcados com os fluorocromos, ao serem submetidos a eletroforese passam pelo feixe de laser, que promove a excitação dos fluorocromos. A luz emitida pelos fluorocromos é detectada por um fotomultiplicador e a informação é processada através de um computador (LABORATÓRIO DE GENÉTICA FUNCIONA /USP, 2001).

O uso dos seqüenciadores automáticos é essencial quando se deseja realizar seqüenciamento em larga escala, como nos projetos genoma. O desenvolvimento e utilização de seqüenciadores automáticos tornam mais eficiente e rápido o seqüenciamento de DNA, já que as etapas de leitura do gel e o processamento de seqüências são realizadas através de programas de computador. A reação de seqüenciamento é realizada através do método de Sanger (1979). Na mistura da reação são utilizados nucleotídeos normais e modificados. Estes últimos não possuem a hidroxila 3’, somente apresentam um H (hidrogênio). Isto impossibilita a ligação do nucleotídeo seguinte, pois não há possibilidade de estabelecimento da ligação fosfodiéster. A quantidade dos dois tipos de nucleotídeos colocados na reação é suficiente para que sejam obtidos fragmentos de todos os tamanhos possíveis de um determinado segmento de DNA. Estes fragmentos serão separados um a um no gel de seqüenciamento, montando a seqüência correta. Quatro diferentes substâncias ligadas aos nucleotídeos modificados são empregadas e, uma vez excitadas por um feixe de laser, emitem luz em diferentes comprimentos de onda, ou seja, emitem quatro cores diferentes. Assim, uma vez que em cada uma das diferentes reações (A, T, C, G) foi empregado um fluorocromo diferente, é possível juntar estes produtos e realizar a eletroforese em um único canal do gel de seqüenciamento. Os produtos da reação de seqüenciamento, marcados com os fluorocromos, ao serem submetidos a eletroforese passam pelo feixe de laser, que promove a excitação dos fluorocromos. A luz emitida pelos fluorocromos é detectada por um fotomultiplicador e a informação é processada através de um computador (PORTAL DA CIÊNCIAS BIOLÓGICAS, 2010).

SEQUENCIAMENTO AUTOMÁTICO EM PLACA DE GEL POLIMERIZADO EM ACRILAMIDA

Conforme o sitio Genesis, 2010:

“O sequenciamento de DNA é um processo que determina a ordem dos nucleotídeos (blocos que constituem a molécula de DNA) em uma amostra. Existem vários métodos disponíveis, e cada um apresenta vantagens e desvantagens. 

Um dos mais utilizado é o chamado “método didesoxi” conhecido também como de “terminadores de cadeia” ou de “Sanger”; ele constitui a base da metodologia empregada no sequenciamento do genoma humano. Sua estratégia consiste em identificar, continuamente e sequencialmente durante o processo, o último nucleotídeo incorporado na extremidade de alongamento da cadeia. Os produtos da reação deverão também portar uma “marca” que permita detecta-los na etapa de análise. Resumidamente, o processo é realizado a partir de uma cadeia simples (não dupla) do DNA a ser sequenciado; esta servirá de molde para gerar a outra metade complementar da dupla hélice. Isto é obtido pela desnaturação da “molécula nativa” 

A reação de síntese se processa em condições iônicas e de pH apropriadas, na presença da enzima DNA polimerase e de uma mistura dos 4 nucleotídeos sob a forma de 3’-desoxinucleotídeo trifosfatos (dNTPs): dATP, dCTP, dGTP e dTTP sendo um deles marcado radioativamente com ³²P ou ; um dos mais utilizado é o dATP ³²P. Como a enzima utilizada catalisa somente o alongamento da cadeia nascente é necessário também, a presença na reação, de um pequeno fragmento de DNA sintético (XXX) complementar a uma região conhecida (YYY) na extremidade 3’ do DNA molde; estas características permitirão sua hibridização no local mencionado, e fornecerão um ponto de partida para a replicação do DNA. O fragmento XXX, denominado iniciador ou “primer", quando marcado, poderá ser utilizado para rastrear o fragmento de DNA recém sintetizado no lugar do dNTP. Fato importante no processo é que ele é executado em quatro reações separadas; cada uma delas, contendo adicionalmente pequena quantidade de um (e apenas um) dos 4 tipos de cada dNTP sob a forma de análogo, 2’, 3’-didesoxinucleotídeo trifosfatos (ddNTPs) 

Estes análogos conhecidos como “terminadores” quando incorporados à cadeia nascente, por não apresentarem 3’OH que permita formar ligação com o próximo dNTP a ser adicionado, bloqueará todo processo. Como todos os nucleotídeos normais (dNTPs) estão presentes, o alongamento da cadeia prosseguirá até que a enzima DNA-polimerase insira um análogo (ddNTP). Consequentemente, haverá parada imediata da reação de síntese no ponto em que seu alongamento foi interrompido: na extremidade e, a molécula estará marcada com ³²P. Os fragmentos assim obtidos, cada qual contendo um resíduo final conhecido, pois se sabe em que tubo de reação o análogo foi adicionado, são separados por tamanho em gel de poliacrilamida individualmente: um canal de análise para cada reação. O gel é “transferido” para um suporte de nitrocelulose (filtro). 

Após auto-radiografia a ordem dos nucleotídeos, na cadeia de DNA recém sintetizada, pode ser visualizada e obtida diretamente; esta é complementar à da molécula sequenciada: que serviu de “molde”. Levando estas observações em consideração, é possível conhecer a sequência de nucleotídeos do DNA sequenciado de 3’para 5’ partindo-se da parte inferior para a superior do gel. 

O método pode ser automatizado através de “maquinaria apropriada” gerenciada por computadores com “softs” que lêm sequencialmente e identificam os produtos. Isto permitirá executar o processo em grande escala. Neste caso utilizam-se simultaneamente os 4 didesoxinucleotídeos terminadores (ddNTPs) marcados por fluorescência. Como cada reação (A,T,G,C) utilizou um fluorocromo diferente os produtos podem ser reunidos e a eletroforese destes realizada em um único canal do gel de sequenciamento. O sinal fluorescente diferencial emitido por cada fragmento, após iluminação com um feixe de laser, identificará os produtos baseado na diferença de comprimento de onda. A luz emitida é detectada por “escaneamento” do gel e a sequência deduzida por computador. Variáveis mais modernas, consequentemente mais rápidas e poderosas, incluem a robotização total do processo com a inclusão das etapas de purificação e da reação de síntese da cadeia do DNA.”

SEQUENCIAMENTO AUTOMÁTICO COM ELETROFORESE CAPILAR

O pesquisador Zukurov em seu sitio descreve:

“Como exemplo vamos mostrar os mecanismos de funcionamento dos mais famosos seqüenciadores automáticos em capilar. Os modelos mais utilizados são 310 Genetic Analyzer, 3100 Genetic Analyzer, 3100-Avant Genetic Analyzer, 3130 Genetic Analyzer, 3130xl Genetic Analyzer, 3730 DNA Analyzer, 3730xl DNA Analyzer. A principal diferença entre todos estes modelos é o número de capilares, para se ter uma pequena idéia o 310 Genetic Analyzer possui apenas um capilar, em outras palavras, corre apenas uma amostra de cada vez. O 3730xl DNA Analyzer por sua vez possui 96 capilares, ou seja, corre até 96 amostra de uma vez. Entretanto não se justifica correr 96 amostra em 96 capilares, os custos se tornam muito elevados... 

O seqüenciador capilar separa fragmentos de DNA utilizando os polímeros POP4, POP6 e POP7. Os tipos de polímeros variam de acordo com o modelo utilizado. Este equipamento raliza seqüenciamento automático e análise de fragmentos longos, médios e curtos, utilizando capilares de 80, 50 e 36 cm respectivamente. Os tamanhos dos capilares também variam de acordo com o modelo de seqüenciador empregado, por exemplo, o 310 Genetic Analyzer utiliza capilares de 36 cm, os modelos mais avançados podem utilizar os três tamanhos diferentes. 

Estes seqüenciadores automáticos analisam as moléculas através do processo de eletroinjeção, na qual não há injeção de volume e sim de moléculas, por isso cada amostra pode ser corrida até cinco vezes. Estes seqüenciadores podem ser utilizados para outras funções além de seqüenciamento, como por exemplo: SNP detection, detecção de diferente mutações, identificação humana por análise de fragmentos, análise de fragmentos amplificados pela PCR através do softwares GeneScan que permite uma sensibilidade muito maior que a detecção por eletroforese em gel. 

As reações de seqüenciamento são realizadas em tubos cônicos do tipo a – tube, estes tubos são inseridos no seqüenciador em um suporte (autosampler tray) com capacidade para 48 ou 96 amostras. O auosampler tray proporciona um contato consecutivo de cada amostra com o eletrodo catado que esta em paralelo a extremidade final do capilar cheio de polímero separador. Na outra extremidade do capilar no suporte do tampão (buffer), um eletrodo anodo esta em paralelo a extremidade do capilar que esta imersa no buffer. 

As moléculas entram no capilar em um fluxo constante, sempre do catodo em direção ao anodo. O período curto em que a eletroforese ocorre no capilar imerso na amostra é chamado de eletroinjeção, pois o volume da amostra continua o mesmo, ou seja, apenas moléculas carregadas como os DNA migram na direção oposta de sua carga. 

Quando os fragmentos de DNA atingem a janela de detecção no capilar, um laser excita os corantes fluorescentes. A emissão proveniente dos diferentes corantes possui cada uma um comprimento de onda diferente, sendo estes diferentes espectros coletados pela câmara CCD (charge – coupled device) também conhecido como dispositivo de carga acoplado. O software de seqüenciamento interpreta os resultados, titulando cada base em relação à intensidade do composto fluorescente, denominado quatro cores especificas. 

O software para analise do seqüenciamento, utiliza as mesmas quatro cores especificas para cada base. Por convenção, A ficou como verde, C como azul, G como preto e T como vermelho na visualização do eletroferograma. 

Rhodamine Dye Terminators – Os corantes fluorescente dRhodamina, são aderidos especificamente aos ddNTPs. 

(...)”

SHOTGUN

Essa técnica dispensa a etapa de mapeamento físico, umas das tarefas mais difíceis e demoradas. O genoma do organismo é fragmentado em pequenos pedaços, por quebra mecânica (sonicação ou nebulização) e diversas bibliotecas são geradas desses fragmentos aleatórios. O tamanho dos fragmentos clonados varia entre 1000 a 4000 pb, podendo chegar a 10.000 pb, as extremidades de um grande número de clones são seqüenciadas e utilizadas para montagem do genoma completo. Apesar de ser estratégia mais rápida, demanda uma alta capacidade computacional para processamento das sequências e montagem correta do genoma. Esta estratégia tem sido empregada para o seqüenciamento de inúmeros genomas de procariontes como de bactérias, por exemplo Xilela fastidiosa e Gluconacetobacter diazotrophicus (consórcio TIOGENE) dentre outras, e também tem sido utilizada para genomas de eucariontes, bem maiores, incluindo o genoma humano. Um grande problema para os projetos de seqüenciamento genômico é a grande quantidade de regiões do genoma com sequências repetidas, o que, dentre outros problemas, dificulta bastante o trabalho final de bioinformática para montagem das sequências. Para suplantar esse problema, mesmo quando se utiliza a estratégia “shotgun” pode ser utilizadas bibliotecas com grandes fragmentos de DNA para auxiliar a ordenação dos clones e montagem do genoma. Alem de diminuir a quantidade de seqüenciamento das bibliotecas “shotgun”. No caso de genomas de organismos eucariontes superior, além da quantidade de DNA repetitivo ser muito maior, esses problemas são agravados pelo fado dos genes possuírem íntrons dificultando ainda mais a montagem e localização das regiões codificantes do genoma. Uma alternativa nesse caso é seqüenciar apenas o Genôma Funcional, ou seja, o DNA complementar ao RNA mensageiros ou ao cDNA. Nesse caso, o RNA total do organismo é extraído, utilizando a síntese de cDNA através da enzima transcriptase reversa, o cDNA é então clonado e seqüenciado (TEXEIRA, 2006; ZUKUROV, 2007).

PIROSEQUENCIAMENTO (SISTEMA 454)

Segundo Texeira (2006):

“ Apesar do aumento significativo da velocidade de seqüenciamento com a utilização dos seqüenciadores automáticos, baseados no método de SANGER et al. (1977), e o desenvolvimento de diferentes estratégias para o seqüenciamento completo do genoma, ainda há uma grande quantidade de trabalho, tempo e recursos financeiros para obtenção de hesito em um projeto de seqüenciamento. Diversos grupos de pesquisa têm realizado esforços para o desenvolvimento de métodos para a determinação do seqüenciamento de DNA. Três métodos são bastante promissores: seqüenciamento por hibridização (BAINS & SMITH, 1988; DRMANAC et al., 1989; KHRAPKO et al., 1989; SOUTHERN, 1989), seqüenciamento por assinatura paralela, baseado na ligação e clivagem do DNA (BRENNER et al., 2000) e o pirossequenciamento é uma técnica baseada na detecção do pirofosfato (PPi) durante a síntese do DNA pela DNA polimerase. Através de uma cascata de reações uma certa quantidade de luz visível é gerada de acordo com o número de nucleotídeos incorporados. Essa cascata é iniciada com a reação de polimerização do DNA e a liberação do PPi como resultado da incorporação no nucleotídeo pela polimerase. O PPi é subsequentemente convertido a ATP através da ATP sulfirilase, o qual fornece energia para a luciferase oxidar luciferina e gerar luz. Anteriormente esse método não era utilizado para o seqüenciamento de genomas em função da limitação do tamanho das leituras (reads) gerados em torno de 80 e 120 pares de base (RONAGUI et al., 1998). No entanto, diversos aprimoramento tecnológicos possibilitaram a automação da reação e o desenvolvimento de um equipamento capaz de seqüenciar 25 milhões de bases, com uma precisão de 99% ou mais, em apenas 4 horas (AGAH et al., 2004; MARGULIES et al., 2005). 

O pirossequenciamento é um método rápido para seqüenciamento que não se baseia em eletroforese. No caso do equipamento desenvolvido pela Roche Apllied Science denominado “Genome sequencer 20 System”, o seqüenciamento pode ser dividido em quatro etapas principais: 1) DNA genômico é isolado e fragmentados com 300 a 800 pares de bases, gerados por nebulização, são ligados a adaptadores e separados em fita simples; 2) os fragmentos ligados são imobilizados em nanoesferas de forma que apenas um fragmento seja ligado a cada esfera; 3) as esferas são capturadas por gotículas de uma emulsão água-óleo contendo os reagentes para a reação de PCR (emPCR). 

A reação de PCR ocorre em cada gota, resultando em esferas contendo em torno de 10 milhões de cópias de um único DNA molde; 4) A emulsão e quebra, as fitas de DNA desnaturas, e as esferas contendo clones de DNA fita simples são depositados em poços de uma lâmina de fibra ótica. Pequenas esferas contendo as enzimas necessárias para a reação de pirossequenciamento imobilizadas são depositadas em cada poço. Após a preparação das esferas a reação de seqüenciamento é realizada através da passagem de uma solução contendo o tampão de reação e os nucleotídeos (A, T, G e C) independentemente, com uma lavagem do sistema após a passagem de cada base. A luz gerada é capturada e utilizada para geração do pirograma. 

Essa tecnologia tem vantagens na exatidão e facilidade de utilização para diferentes aplicações. Dispensa a clonagem, construção de biblioteca e seleção de clones, marcação de nucleotídeos, e a eletroforese de DNA. Além disso, possui alta flexibilidade e suposta alto nível de automação. Apesar de produzir sequências com tamanhos entre 80 e 120 pares de bases, o que poderia ser um problema para a montagem do genoma, o desenvolvimento de algoritmos matemáticos específicos e o grande número de sequências geradas, torna possível o seqüenciamento de umgenôma bacteriano em poucos dias (MARGULIES et al., 2005). Certamente se para o organismo de interesse já houver algum genoma seqüenciado será muito mais fácil a montagem do genoma e dessa forma, dada a velocidade de seqüenciamento, essa plataforma tecnológica poderá ser muito utilizada para seqüenciamento de genomas microbianos em larga escala e a “tipagem” baseadas na sequência do genoma.”

BIBLIOGRAFIA

AMABIS, José Mariano; CAMARGO, Solange Soares de. Simulando a técnica de seqüenciamento do DNA. Projeto Micro&Gene, USP, sem data;

ANTUNES, Michelle Bueno de Moura P.. A importância do Projeto Genoma. Orientador: Paiva, Luciano Vilela. Apresentação de Slides, UFL, sem data;

CARUSO, Célia Sulzbacher. Clonagem, expressão e caracterização de proteínas recombinantes de Xylella fastidiosa. Orientador: Carrilho, Emanuel. Tese de Doutrorado, USP, 2007; pp.21-22;

CHEMELLO, E. Química Virtual. Março, 2007;

COSTA-PINTO, Diamar. Técnicas Básicas de Biologia Molecular. Apresentação de Slides, FIOCRUZ, sem data;

DIAS, Cristiane Kioko Shimabukuro. Sequenciamento de DNA: Métodos e princípios. Apresentação de Slides. Instituto de biociências, UNESP – Botucatu(SP);

FREITAS, Patrícia Domingues de. Manual prático: Estudos de diversidade genética em camarões utilizando marcadores moleculares. São Carlos-SP, 2005;

IGLESIAS, Grabriela. Técnicas de Biologia Molecular. Apresentação de Slides, 2003;

Laboratório de Genética Funcional da USP. Apostila: Genética molecular e tecnologia do DNA recombinante, 2001. , acessado em Janeiro de 2010;

Laboratório Genesis , acessado em Janeiro de 2010;

MOLINA, Adriana Lopes; TOBO, Patrícia Renovato. Uso das técnicas de biologia molecular para diagnóstico. Série – Biologia molecular, einstein. 2004;2(2):139-142;

Papo Ciências , acessado em Janeiro de 2010;

PINTO, Fabiana G. S. Sequenciamento genômico: técnicas e aplicações. Apresentação de Slides, sem data;

PIRES-ALVES, Melissa; NOVAIS, Caroline Monteiro. PCR em Tempo Real. Revista Biotecnologia, Ciências & Desenvolvimento, 33ª Ed, Julho/Dezembro:2004; pp. 10-13;

Portal Ciências Biológicas , acessado em Janeiro de 2010;

Revista Albert Einstein , acessado em Janeiro de 2010;

TEIXEIRA, Kátia Regina dos Santos. Genômica e Proteômica: Embrapa Agrobiologia, 2006, (Documento, 213) PP. 8-18;

TEKIEL, Valeria. Métodos de secuenciación de ADN. Apresentação de Slides, sem data;

WATSON, James D. DNA: O segredo da vida. Companhia das letras, São Paulo, 2008. pp. 119-123, 194-197;

ZAPATA, Jéssica. Secuenciación de ADN. Apresentação de Slides, Organización Celular y Molecular II – 2006;

ZUKUROV, Jean Paulo Lopes. Metodologias do seqüenciamento da molécula de DNA, 2007. , acessado em Janeiro de 2010

SEQUENCIAMENTO GENÉTICO - PARTE 1

PACINI, Diogo Barth. 

INTRODUÇÃO

No sitio do Papo Ciência (2010), encontramos a seguinte definição:

“O seqüenciamento é a técnica utilizada para determinar em que ordem as bases (letras) contidas no DNA, se encontram. Esta é apenas a primeira etapa de um processo cujo resultado final poderá resultar em novos métodos de diagnóstico, na formulação de novos medicamentos, vacinas, na prevenção e tratamentos mais eficazes contra doenças ou pragas.

O trabalho de seqüenciamento começa com a preparação das chamadas bibliotecas de DNA. Nessa fase, o genoma a ser mapeado é 'picotado' em inúmeros fragmentos. Esses pequenos trechos de DNA são então clonados, ou seja, cada trecho é ligado a uma estrutura que possui a capacidade de se multiplicar chamada plasmídeo. Estes plasmídeos são então inseridos em bactérias que são crescidas em meios específicos para multiplicação dos trechos originais do genoma em estudo.

Só após esse procedimento é iniciado o seqüenciamento do genoma propriamente dito. As bases do DNA são marcadas com cores diferentes e introduzidas no seqüenciador. Um feixe de raio laser, detecta precisamente em que ordem estão as bases nitrogenadas - adenina (A), citosina (C), guanina (G) e timina (T). Este procedimento possui inúmeras aplicabilidades, incluíndo testes de paternidade.

As técnicas de seqüenciamento têm evoluído consideravelmente, tornando o processo automatizado, mais rápido e acessível a um maior número de pesquisadores. No início dos anos 70, eram necessários dois anos para seqüenciamento de 20 bases de DNA. O processo era manual e envolvia o uso de material radioativo. Atualmente, com o desenvolvimento das técnicas de seqüenciamento automático, um aparelho de sequenciamento é capaz de seqüenciar meio milhão de pares de bases por dia.”

O INICIO DO SEQUENCIAMENTO

Desde a descoberta da dupla fita de DNA surgiram diversas ciências, entre elas a genética e a biologia molecular, ambas trabalham com o estudo dos genes, suas interações, a produção de proteína, com o intuito de se conhecer mais sobre o funcionamento de um organismo e/ou célula, além de conhecer possíveis doenças e tentar achar cura.

Para que isso fosse possível foi necessário descobrir várias técnicas, entre elas a de seqüenciamento genético. Onde por algumas metodologias fossem feitas várias cópias do gene de interesse e com isso se descubra as ordens das bases nitrogenadas.

Segundo MOLINA & TOBO (2004):

“As técnicas hoje utilizadas na genética molecular têm sido desenvolvida a partir da pesquisa acadêmica básica, em diferentes campos da atividade científica. O trabalho de Watson e Crick, em 1953, onde foi proposta a estrutura de dupla-fita do DNA, Marcou a revolução molecular.
Em 1975, Nathans e Smith purificaram enzimas de restrição, ferramentas essenciais para a manipulação in vitro do DNA. Estas foram de fundamental importância para o isolamento e amplificação de fragmentos específicos de DNA para a clonagem in vivo, tecnologia desenvolvida a partir das técnicas de DNA recombinante descritas por Berg em 1972. Tambem em 1975 uma nova metodologia, denominada Southern Blotting, começou a ser usada para investigar a localização de genes e marcou o início da aplicação destas tecnologias no estudo das doenças genéticas.
Em 1977, técnicas de seqüenciamento perimitiram a identificação de alterações específicas na sequência de DNA e a associação destas com diferentes doenças genéticas. Depois disso, o principal marco no desenvolvimento das técnicas de diagnóstico molecular foi a técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR), um método de clonagem in vitro proposto por Kary Mullis em 1987. (...)”

Existem basicamente dos tipos de métodos para o seqüenciamento do DNA, o primeiro método de seqüenciamento de DNA foi desenvolvido em meados dos anos 70 e ficou conhecido como seqüenciamento químico ou Maxam-Gilbert sequencing. O segundo método de seqüenciamento de DNA a ser desenvolvido ficou conhecido como seqüenciamento enzimático ou Sanger-Coulson sequencing. Embora o primeiro método tenha tido uma ampla aplicação inicialmente, o segundo método tornou-se mais reprodutível e utilizado ao longo das décadas (ZUKUROV, 2007).

Conforme Watson (2008) em seu livro DNA – O segredo da vida:

“(...)
... o progresso da biologia molecular na segunda metade dos anos 1970 não foi totalmente interrompido por questões políticas. Na realidade, fomos testemunhas nesses anos de vários avanços importantes, a maioria deles relacionada a ainda controvertida tecnologia de clonagem molecular de Boyer-Cohen. A descoberta mais significativa foi a invenção dos métodos de ler sequências de DNA. O seqüenciamento do DNA depende de haver uma grande quantidade disponível do trecho da molécula em que se está interessado; logo, não era algo exeqüível – exceto no caso dos pequenos DNAs dos vírus – antes que a tecnologia de clonagem fossem desenvolvidas. Como vimos, clonar em essência, significa inserir um pedaço desejado de DNA num plasmídeo, que por sua vez é inserido numa bactéria. As bactérias então se dividem e crescem, produzindo um enorme número de cópias do fragmento de DNA – que, ao serem extraídas das bactérias, fornecem uma grande quantidade do fragmento de DNA desejado, que pode então ser seqüenciado.

Duas técnicas de seqüenciamento foram desenvolvidas concomitantemente, uma por Wally Gilbert em Cambridge, Massachusetts (Harvard), e a outra por Fred Sanger em Cambridge, Inglaterra. O interesse de Gilbert pelo seqüenciamento de DNA surgiu quando ele isolou a proteína repressora do sistema regulador do gene da beta-galactosidase na E.coli. Como vimos, ele mostrara que a proteína repressora se liga ao DNA próximo do gene, impedindo-o de ser transcrito em cadeias de RNA. Agora Gilbert queria conhecer a sequência dessa região do DNA. Um encontro fortuito com o brilhante químico soviético Andrei Mirzabekov sugeriu-lhe uma maneira de usar certas combinações potentes de produtos químicos para romper as cadeias de DNA exatamente no sítio das bases em questão.

(...)

Contudo, dos dois métodos de seqüenciamento, foi o de Sanger que melhor superou o teste do tempo. Alguns dos produtos químicos necessários para quebrar o DNA do método de Gilbert são difíceis de usar; um mero descuido e podem começar a quebrar o DNA do próprio pesquisador. O Método de Sanger, por outro lado, utiliza a mesma enzima que copia DNA naturalmente nas células, a DNA polimerase. O truque era fazer a cópia a partir de pares de bases ligeiramente alterados. Em vez de usar apenas as bases “desoxi” (As, Ts, Gs e Cs) encontradas naturalmente no DNA (ácido desoxirribonucléico), Sanger acrescentou algumas bases ditas “didesoxi”, que possuem uma proximidade curiosa: a DNA polimerease não tem nenhuma dificuldade em incorporá-las na cadeia de DNA em crescimento (isto é, na cópia que está sendo produzida como complemento da fita-molde), mas em seguida não consegue acrescentar nenhuma outra base à cadeia. Em outras palavras, não há como uma cadeia duplicada por esse método estender-se para além de uma base didesoxi.

Imagine uma fita-molde cuja sequência seja GGCCTAGTA. Existem muitas, muitas cópias dessa feita no experimento. Imagine agora que essa fita esteja sendo copiada por meio da DNA polimerasena presença de uma mistura da A, T, G e C normais e também um pouco de A didesoxi. A enzima começará a copiar o DNA, acrescentando primeiro um C (correspondente ao G inicial), depois outro C, em seguida um G e então outro G. Mas, quando a enzima chega ao primeiro T, surgem duas possibilidades: acrescentar um A normal ou um A didesoxi à cadeia. Se incluir um A didesoxi, a fita não poderá continuar crescendo e o resultado será uma cadeia curta que termina em um A didesoxi (ddA): CCGGddA. No entanto, se incluir um A normal, então a DNA polimerase pode continuar acrescentando bases: T, C etc. A próxima chance de o A didesoxi provocar uma “parada” desse tipo só virá quando a enzima chegar ao T segueinte. Novamente aqui, ela poderá acrescentar um A normal ou um ddA. Se acrescentar um ddA, o resultado será outra cadeia truncada, embora um pouco mais comprida que a anterior, cuja a sequência será CCGGATCddA. E assim acontecerá cada vez que a enzima encontrar um T, ou seja, cada vez que tiver a ocasião de acrescentar um A à cadeia. Se, por acaso, um A normal for selecionado, a cadeia continuará; mas, sempre que um ddA for escolhido, a cadeia chega ao fim.

O que isso nos diz? No final desse experimentos, temos uma grande quantidade de cadeias de comprimentos variáveis, todas copiadas do molde de DNA. O que elas têm em comum? O fato de terminarem com um ddA.

Agora imagine o mesmo processo usando as três outras bases: no caso da T, por exemplo, podemos utilizar uma mistura de A, T, G e C normais mais DDT. As molecualas resultantes serão CCGGAddT ou CCGGATCAddT.

Depois de promover a reação das quatro maneiras possíveis – com ddA, ddT, ddG e ddC -, teremos quatro grupos de cadeias de DNA: uma composta de cadeias terminado em ddA, uma das cadeias terminando em ddT e assim por diante. Se agora conseguirmos classificar essas minicadeias de acordo com o comprimento de cada uma (que varia ligeiramente), poderemos inferir uma sequência. Como? Um momento, por favor. Primeiro, vejamos como seria possível efetuar uma triagem. Podemos colocar todos os fragmentos de DNA numa placa contendo um gel especial e colocar a placa sob um campo elétrico. Devido à atração desse campo elétrico, as moléculas de DNA serão forçadas a migrar pelo gel, e à velocidade com que determinada minicadeia avança de acordo com seu tamanho: cadeias curtas avançam mais depressa que cadeias longas. Após certo Intervalo de tempo, a menor minicadeia – no nosso caso, um simples ddC – terá percorrido uma distância ligeiramente menor; e o percurso da minicadeia subseqüente – CCddG – terá sido um pouco menor ainda. O truque de Sanger já deve ter ficado claro: ao ler as posições relativas de todas essas minicadeias após uma corrida cronometrada pelo gel, podemos inferir as sequências de nosso pedaço de DNA: primeiro teremos um C, depois outro C, um G em seguida, e assim por diante.

Em 1980, Sanger dividiu o prêmio Nobel de química com Gilbert e Paul Berg, que foi reconhecido por sua contribuição ao desenvolvimento das tecnologias do DNA recombinante. 

(...)”

REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)

De acordo com MOLINA & TOBO (2004):

“ A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma das técnicas mais empregadas nas diversas áreas do diagnóstico molecular. A sua introdução resultou em grande revolução tecnológica, permitindo a amplificação de uma sequência de interesse contida em uma amostra complexa de DNA e possibilitou a adoção de métodos automatizados para a análise do genoma. A tecnologia da reação em cadeia da polimerase também é bastante flexível, permitindo uma série de modificações que possibilitam o seu emprego na análise de uma grande variedade de amostras. 

Para a realização da PCR, utiliza-se uma enzima termoestável (DNA polimerase) que, na presença de um par de oligonucleotídeo iniciadores (primeres) e dos nucleotídeos que compõem a molécula de DNA, amplifica a região de interesse a partir de uma pequena quantidade de DNA. Esta amplificação ocorre durante repetidos ciclos de temperatura, a saber: 94ºC para desnaturação do DNA, 45ºC a 70ºC para hibridização dos oligonucleotídeos às sequências-alvo e 72ºC para a síntese do DNA, em um equipamento chamado de termocicladores. O DNA amplificado pode, então ser separado e visualizado em géis de agarose ou poliacrilamida e utilizado para diversos fins. 

Entre as principais técnicas resultantes de modificações da reação em cadeia da polimerase, podemos citar o RT-PCR, nested PCR, multiplex PCR, PCR a partir de primers randômicos e PCR em tempo real. O RT-PCR utiliza uma enzima chamada transcriptase reversa para converter uma amostra de RNA em cDNA antes da etapa de amplificação pro PCR, permitindo estudo de vírus de RNA e análise de expressão gênica. O nested PCR, que emprega uma segunda etapa de amplificação com um par de primers internos aos utilizados na primeira etapa e visa aumentar a sensibilidade e especificidade do método. Já PCR multiplex é uma reação de amplificação desenhada para detectar múltiplas sequências-alvo numa mesma amostra. PCR a partir de primers randômicos utiliza sequências curtas de oligonucleotideoas para amplificar regiões repetidas de DNA genômico e é bastante empregado em estudos epidemiológicos. Finalmente, PCR em tempo real permite que a amplificação e a detecção ocorram simultaneamente, num sistema fechado, sendo necessário para isto um termociclador que possua sistema de monitoramente de emissão de fluorescência. Estas técnicas é empregada para quantificação de amostras, como para testes de carga viral, e monitoramento de doença residual mínima.”

Ainda podemos acrescentar uma parte da apostila do Laboratório de Genética Funcional da USP (2001), que descreve a reação em cadeia da polimerase (PCR, Polymerase Chain Reaction), foi idealizada em meados de 1980 e totalmente descrita em 1987.

A maior aplicação desta metodologia é a possibilidade de se amplificar uma determinada sequência do DNA sem a necessidade do uso das tradicionais técnicas de clonagem molecular. Uma simples cópia de um gene específico dentro de um genoma pode ser amplificado para alguns microgramas, partindo-se de quantidades mínimas como sub picogramas de DNA total. A condição básica para a aplicação da técnica, depende da construção de oligonucleotídeos (iniciadores) os quais são complementares as duas fitas opostas do DNA e que estejam flanqueando a sequência a ser amplificada.

O processo inicia-se com a desnaturação da dupla fita do DNA que contém a sequência a ser amplificada. Geralmente, a desnaturação é realizada a uma temperatura de 94° C durante 5 minutos, onde nesta temperatura as duas fitas do DNA separam-se.

O passo seguinte, consiste em abaixar a temperatura para níveis ao redor de 35° C, permitindo que os oligonucleotídeos iniciadores anelem-se especificamente nas extremidades flanqueadas da sequência alvo e nas fitas opostas. Finalmente, a temperatura é elevada para aproximadamente 72° C e com isto a polimerase copia a sequência alvo a partir dos oligonucleotídeos iniciadores é a fase de extensão.

Inicialmente, usou-se a DNA polimerase da Escherichia coli, cuja temperatura ótima é de 37° C. Ela era adicionada manualmente a cada ciclo porque o passo de desnaturação a 94° C inativava a enzima.

Como podemos ver, o processo basicamente ocorre em 3 fases: desnaturação, anelamento e extensão, os quais, constituem um ciclo da reação de amplificação (Figura 35). Inicialmente, usou-se a DNA polimerase da Escherichia coli, cuja temperatura ótima é de 37° C. Ela era adicionada manualmente a cada ciclo porque o passo de desnaturação a 94° C inativava a enzima.

Um importante avanço técnico no processo surgiu com a descoberta da Taq polimerase (Sarki et al, 1988) oriunda da bactéria Thermus aquaticus a qual vive em fontes de água à temperatura de 75° C. A enzima tem uma temperatura ótima de ação a 72° C, mas permanece razoavelmente estável mesmo a 94° C e com isto, a enzima é adicionada uma única vez. Devido a este fato, foi possível a automatização do processo nos chamados termocicladores.

Além da molécula do DNA, também o RNA pode ser amplificado desde que ele seja primeiro convertido para cDNA através da transcrição reversa. Além do principal uso do PCR que é o processo de amplificação de sequências específicas, rapidamente surgiram novas aplicações para esta poderosa metodologia, tais como: sequenciamento de nucleotídeos, análise do polimorfismo, diagnóstico de doenças genéticas e infecciosas e várias outras aplicações mais específicas durante o uso da metodologia do DNA recombinante.”

Quando a técnica foi lançada ela apresentava diversas fatores que tornava muito trabalhoso, como por exemplo podemos citar a inexistência de um equipamento automatizador, como o termociclador (um equipamento elétrico que contém uma placa térmica e um sistema para aumentar e diminuir a temperatura interna rapidamente, e o tempo e as temperaturas dos ciclos são pré-programados), antigamente eram utilizados 3(Três) banhos-maria, com as devidas temperaturas (controladas por termômetros), e o tempo era controlada com um cronômetro, e o pesquisador (na verdade os estagiários) eram responsável por mudar a amostra de um banho-maria para outro por diversas vezes.

Segundo WATSON (2008), ... um grave problema inicial da reação em cadeia da polimerase, a enzima responsável pela multiplicação, é destruída a 95ºC. Por tanto, torna-se necessário obter enzimas novas em cada um dos 25 ciclos do processo. A polimerase é cara, de modo que logo ficou evidente que a sua reação em cadeia, por maior que fosse o potencial, não seria uma ferramenta economicamente viável se significasse “transformar em fumaça” enormes quantidades de material. Mas a natureza acabou dando uma mãozinha. Muitos organismos vivem em temperaturas muito superiores aos 37ºC ideais para a E.coli, a fonte original da enzima; as proteínas dessas criaturas, incluindo enzimas como a DNA polimerase, foram se adaptando ao longo de milênios de seleção natural para suportar o calor. Hoje, a reação em cadeia da polimerase costuma ser realizada usando uma forma de DNA polimerase derivada da Thermus aquaticus, uma bactéria que vive nas terma quentes do parque nacional Yellowstone.

RT-PCR

É uma reação da transcriptase reversa, seguida da reação em cadeia da polimerase . Não utiliza o DNA de cadeia dupla como molde e sim RNA de cadeia simples. A partir do RNA, a enzima transcriptase reversa sintetiza uma cadeia de DNA complementar (chamado agora de cDNA). Ao cDNA aplica-se a técnica de PCR. A técnica de RT-PCR é amplamente utilizada para verificar a expressão gênica, uma vez que analisa o RNA responsável pela síntese de proteínas. Se há uma proteína específica, é porque há DNA sendo expresso e originando mRNA para tal proteína. A expressão para produção de diferentes proteínas varia conforme a localização da célula dentro do organismo: células cardíacas expressam proteínas diferentes de células musculares, por exemplo (WIKIPÉDIA, 2010).

NESTED-PCR

É uma variação da reação em cadeia da polimerase (PCR), em que dois pares (ao invés de um par) de iniciadores da PCR são utilizados para amplificar um fragmento.O primeiro par de iniciadores da PCR amplifica um fragmento semelhante a um padrão de PCR. No entanto, um segundo par de primers chamados primers alinhados (como eles mentem / são alinhadas dentro do primeiro fragmento) vincular o primeiro fragmento do produto da PCR para permitir a ampliação de um segundo produto da PCR, que é mais curto do que o primeiro. A vantagem de Nested-PCR é que, se o fragmento da PCR foi amplificado errado, a probabilidade é muito baixa que a região seria amplificado pela segunda vez pelo segundo conjunto de primers (PCR STATIO, 2010) .

SOUTHERN BLOTTING

Southern blotting, recebeu o nome de Edward M. Sul que desenvolveu este procedimento na Universidade de Edimburgo na década de 1970. Para simplificar, as moléculas de DNA são transferidas de um gel de agarose para uma membrana. Southern blotting é projetado para localizar uma determinada seqüência de DNA dentro de uma mistura complexa. Por exemplo, borrar do sul poderia ser usado para localizar um gene específico dentro de um genoma inteiro. A quantidade de DNA necessário para esta técnica é dependente do tamanho e da atividade específica da sonda. Sondas curtas tendem a ser mais específico. Em condições ideais, pode-se esperar para detecção de 0,1 pg de DNA para que você está investigando (MAMA JI’S, 2010).

NORTHERN BLOTTING

Esta técnica utiliza o princípio da técnica southern blotting, entretanto não para detectar um segmento especifico de DNA, mais um segmento de uma molécula de RNA (RNAm e RNAr), sendo que esta técnica é amplamente utilizada para verificar a expressão celular. Os mesmos procedimentos utilizados para a técnica de southern blotting também se aplicam aqui, ou seja: extração de RNA, endonucleases de restrição, separação dos fragmentos com eletroforese, transferência para membrana de nylon, pré-hibridização e hibridização com sonda marcada radioativamente, com cor ou quimioluminescência para que sua visualização seja possível. Através desta técnica foi possível estudar a expressão gênica de células, bactérias, parasitas, fungos, plantas, etc... através da molécula de RNAm (RNA mensageiro) sintetizada durante o processo de transcrição (ZUKOROV, 2010).

WESTERN BLOTTING

Western blotting é uma técnica usada para identificar e localizar proteínas com base em sua capacidade de se ligar a anticorpos específicos. A análise ocidental do borrão pode detectar sua proteína de interesse de uma mistura de um grande número de proteínas. Western blot pode dar-lhe informações sobre o tamanho de sua proteína (com comparação com um marcador de tamanho ou escada em kDa), e também dar-lhe informações sobre expressão da proteína (com comparação com um controle, como amostra não tratada ou outro tipo de célula ou tecido). A análise ocidental do borrão pode analisar toda a amostra da proteína se das células ou tecidos, mas também pode analisar proteínas recombinantes sintetizadas in vitro. Borrão ocidental é dependente da qualidade do anticorpo usado para sondar para sua proteína de interesse, e como ele é específico para este anticorpos contra a proteína. são facilmente obtidos de fontes comerciais, e você pode comprar um para sua proteína de interesse. Se sua proteína é uma proteína da novela, você deve produzir um anticorpo se ou obter uma empresa para fazer isso por você. Neste caso, você precisará de pelo menos uma pequena quantidade de sua proteína purificada ou dos extratos da pilha ou feita como uma forma recombinante (ou seja, in vitro ou em um sistema de expressão de proteínas recombinantes). Anticorpos específicos para o seu proteínas são vitais para borrar ocidental como elas são vincular a possibilidade especificamente à sua proteína de interesse em vez dos milhares de proteínas em sua western blot (MOLECULAR STATION, 2010).

MULTIPLEX-PCR

É uma variante da PCR, que permite a amplificação simultânea de muitos alvos de interesse em uma reação usando mais de um par de primers. Desde sua primeira descrição em 1988 por Chamberlain et al, esse método foi aplicado em muitas áreas de testes de DNA, incluindo análises de deleções, mutações e polimorfismos, ou ensaios quantitativos e PCR de transcrição reversa. Normalmente, é utilizado para aplicações onde a genotipagem, análise simultânea de múltiplos marcadores é necessária, a detecção de patógenos ou organismos geneticamente modificados (OGM), ou por análise de microssatélites. Ensaios Multiplex pode ser tedioso e demorado para estabelecer, exigindo procedimentos de otimização demorado (PROTOCOL ONLINE, 2010) .

RFLP

Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP), é uma diferença de seqüências homólogas de DNA que pode ser detectada pela presença de fragmentos de diferentes comprimentos, após digestão das amostras de DNA em questão com endonucleases de restrição específicas. RFLP, como um marcador molecular, é específico para um único clone / combinação de enzimas de restrição. A maioria dos marcadores RFLP são co-dominantes (ambos os alelos na amostra heterozigótica será detectado) e altamente locus específico.Uma sonda de RFLP é uma seqüência de DNA marcado que cruza com um ou mais fragmentos da amostra de DNA digerido, depois eles são separados por eletroforese em gel, revelando um padrão único característico para borrar um genótipo específico em um locus específico. Curtas, simples ou de baixa cópia do DNA genômico ou cDNA clones são normalmente utilizados como sondas de RFLP. As sondas RFLP são freqüentemente usadas em mapeamento do genoma e na análise da variação (genotipagem, forense, testes de paternidade, diagnóstico de doenças hereditárias, etc.) (NCBI, 2010).

RAPD

Random Amplification Polymorphic DNA. É um tipo de reação de PCR, mas os segmentos de DNA que são amplificados são aleatórios. O cientista realizando RAPD cria vários primers curtos (8-12 nucleotídeos), prossegue com a PCR, utilizando um grande modelo de DNA genômico, esperando que amplificar os fragmentos. Resolvendo os padrões resultantes, um semi-perfil original pode ser adquirida a partir de uma reação de RAPD. Nenhum conhecimento da seqüência de DNA para o gene-alvo é necessário, como os iniciadores irá ligar em algum lugar na seqüência, mas não é certo exatamente onde. Isso torna o método popular para comparar o DNA dos sistemas biológicos que não tiveram a atenção da comunidade científica, ou em um sistema no qual as seqüências de DNA são relativamente poucas comparadas (que não é adequado para a formação de um banco de DNA). Porque ele mantém um grande modelo de seqüência de DNA intacto, tem algumas limitações no uso de amostras de DNA degradado. Seu poder de resolução é muito inferior ao previsto. Nos últimos anos, RAPD tem sido utilizada para caracterizar e traçar, a filogenia de diversas plantas e espécies animais (WIKIPÉDIA, 2010).

PCR EM TEMPO REAL

Segundo Pires-Alves & Novais (2004):

“(...) Ultimamente, uma inovação tecnológica resultante da PCR, denominada de PCR em Tempo Real, vem ganhando espaço nos diagnósticos clínicos e nos laboratórios de pesquisa por apresentar a capacidade de gerar resultados quantitativos. Essa técnica permite o acompanhamento da reação e a apresentação dos resultados de forma mais precisa e rápida, em relação à PCR que apresenta somente resultados qualitativos. 

A possibilidade de monitorar a PCR em tempo real revolucionou o processo de quantificação de fragmentos de DNA e RNA. A PCR em tempo real realiza a quantificação destes ácidos nucléicos de maneira precisa e com maior reprodutibilidade, por que determina valores durante a fase exponencial da reação. O ponto que detecta o ciclo na qual a reação atinge o limiar da fase exponencial é denominado de Cucle Thresbold. Este ponto permite a quantificação exata e reprodutível baseado na fluorescência. 

A emissão dos compostos fluorescentes gera um sinal que aumenta na proporção direta da quantidade de produto da PCR. Sendo assim, os valores da fluorescência são gravados durante cada ciclo e representam a quantidade de produto amplificado (http://www.ncifcrf.gov/rtp/gel/rtqpcr/whatis.asp, 2004). Os compostos fluorescentes mais utilizados são o SYBR® Green e TaqMan®. 

A PCR em tempo real requer uma plataforma de instrumentação que contém um termociclador com sistema ótico para a excitação da fluorescência e na coleção da emissão e um computador com um software para aquisição de dados e análise final da reação. Estas máquinas, disponíveis de diversos fabricantes, diferem na capacidade da amostra (96-poços padrão, processamento de poucas amostras ou requerem tubos capilares de vidro especializados), no método da excitação (lasers ou fontes claras do espectro largo com filtros ajustáveis), e na sensibilidade total. Há também diferenças nos software para o processamento dos dados (http://www.ambion.com/techlib/tn/81/813.html, 2004). 

Os fluoróforos são moléculas que absorvem e emitem luz em um comprimento de onda específico. Os sistemas de detecção da PCR em Tempo Real utilizam estas moléculas que proporcionam o acompanhamento da reação ao longo dos ciclos. 

O SYBR® Green se liga entre a fita dupla de DNA e com a excitação da luz emitida pelo sistema ótico do termociclador, emite uma fluorescências verde. As vantagens da utilização do SYBR® Green são: baixo custo, facilidade no uso e sensibilidade. A desvantagem é a ligação em todo DNA fita dupla que surge durante a reação, incluindo os dímeros dos iniciadores e outros produtos inespecíficos, podendo superestimar a concentração do fragmento alvo. O SYBR® Green não ligado ao DNA exibe uma fluorescência muito pequena. Entretanto, a fluorescência é realçada quando ligada na fita dupla do DNA. 

(...) 

As duas alternativas mais utilizadas além do SYBR® Green são TaqMan® e Molecular Beacons, ambos com capacidade de hibridização gerando transferência de energia para quantificação. 

TaqMan® é uma sonda (fragmento de DNA marcado usado para hibridizar outra molécula de DNA) utilizada para detectar sequências específicas nos fragmentos de DNA amplificados na PCR. Esta sonda apresenta em uma extremidade um fluoróforo, e na outra extremidade um quencher (molécula que aceita energia do fluoróforo na forma de luz e a dissipa na forma de luz ou calor). Os produtos da reação são detectados pela fluorescência gerada após a atividade exonuclease 5’ --> 3’ da Taq DNA polimerase. 

(...) 

A reação com a TaqMan® é considerada um método sensível para determinar a presença ou ausência de sequência específicas (HOLLAND et al., 1991). 

Molecular beacons são oligonucleotídeos usados como sondas de fita simples que formam uma estrutura secundária entre a extremidades 5’ e 3’, chamada de haste-e-loop. O loop contém uma sequência que é complementar à sequência-alvo e a haste é formada pelo anelamento das sequências complementares que estão localizadas nas extremidades. Um fluoróforo é covalentemente ligado no final de uma extremidade e um quencheré covalentemente ligado na outra extremidade. Os oligonucleotídeos molecular beacons não emite fluorescência quando estão livres em solução. Entretanto, quando hibridizam com a fita de DNA contendo a sequência-alvo, as sondas assumem uma mudança conformacional tornando-a capaz de emitir fluorescência. 

(...) 

Os molecular beacons podem ser sintetizados com diferentes cores de fluoróforos, possibilitando ensaioas que necessitam detectar diferentes alvos em uma mesma reação. São altamente específicos permitindo discriminar sequências-alvo que diferem entre si por apenas um nucleotídeo substituído. São sondas idéias, no ensaio diagnóstico para identificação genética, detecção de SNP (singlenucleotidepolymorfism) e aplicações farmacogenéticas (KRAMER,2004). 

O sistema de quantificação em tempo real tem as seguintes aplicações:

•  Identificação de alelos em DNA genômico;
•  Análise de sequências virais, bacterianas ou de protozoários a partir de várias fontes;
•  Análise de patógenos em alimentos;
•  Análise de produtos transgênicos;

A aplicação em diagnósticos, como a detecção de patógenos, ou doenças, torna-se interessante uma vez que esta técnica permite a quantificação e rapidez do resultado, pois não mais requer a detecção em gel de eletroforese, necessário na análise da PCR. 

(...)”

BIBLIOGRAFIA

COSTA-PINTO, Diamar. Técnicas Básicas de Biologia Molecular. Apresentação de Slides, FIOCRUZ, sem data;

DIAS, Cristiane Kioko Shimabukuro. Sequenciamento de DNA: Métodos e princípios. Apresentação de Slides. Instituto de biociências, UNESP – Botucatu(SP);

IGLESIAS, Grabriela. Técnicas de Biologia Molecular. Apresentação de Slides, 2003;

Laboratório de Genética Funcional da USP. Apostila: Genética molecular e tecnologia do DNA recombinante, 2001. , acessado em Janeiro de 2010;

MAMA JI’S. Disponível em: acessado em Janeiro de 2010;

MANCA, Vincenzo. DNA computing – Modelli di calcolo non convenzionali. Sem dados;

Molecular Station. Disponível em: acessado em Janeiro de 2010;

MOLINA, Adriana Lopes; TOBO, Patrícia Renovato. Uso das técnicas de biologia molecular para diagnóstico. Série – Biologia molecular, einstein. 2004;2(2):139-142;

NCBI , acessado em Janeiro de 2010;

NETO, Carlos Rodrigues Borges; et al..Reação de sequenciameno de DNA e purificação – Protocolos otimizados. Embrapa Cenargen, Brasília-DF, 2003;

Papo Ciências , acessado em Janeiro de 2010;

PCR Station , acessado em Janeiro de 2010;

PIRES-ALVES, Melissa; NOVAIS, Caroline Monteiro. PCR em Tempo Real. Revista Biotecnologia, Ciências & Desenvolvimento, 33ª Ed, Julho/Dezembro:2004; pp. 10-13;

Protocol Online , acessado em Janeiro de 2010;

RAPD – Wikipédia , acessado em Janeiro de 2010;

RT-PCR – Wikipédia , acessado em Janeiro de 2010;

SANGER, F; NICKLEN, S; COULSON, A. R.. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA; Vol. 74, nº 12, pp. 5463-5467, December 1977;

WATSON, James D. DNA: O segredo da vida. Companhia das letras, São Paulo, 2008. pp. 119-123, 194-197;

ZUKUROV, Jean Paulo Lopes. Metodologias do seqüenciamento da molécula de DNA, 2007. , acessado em Janeiro de 2010;

ZUKUROV, Jean Paulo Lopes. Southern e Northern Blotting, 2007. , acessado em Janeiro de 2010.